Silenziamento di microRNA basato su Potato Virus X in piante di patata

In questo articolo

Abstract

Fonte: Zhao, J., et al. Silenziamento basato sul virus X della patata (VbMS) dei microRNA nella patata. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video illustra l'uso di Agrobacterium tumefaciens per veicolare un costrutto basato sul Potato Virus X (PVX) in piante di patata coltivate in vitro, al fine di ottenere un silenziamento virale dei microRNA (VbMS). Il metodo consente la soppressione sistemica di un microRNA bersaglio, permettendo ai ricercatori di studiarne il ruolo nello sviluppo della pianta attraverso cambiamenti fenotipici osservabili.

Protocollo

1. Eseguire il saggio VbMS basato su PVX in piante di patata.

Trapiantare piante di patata in vitro di 4 settimane in terreno. Le piante trapiantate saranno sottoposte al saggio VbMS 3–4 giorni dopo.
Inoculare le piante di patata con Agrobacterium contenente i plasmidi PVX-STTM (Short Tandem Target Mimic).
NOTA: Per il saggio VbMS nella patata, l'infiltrazione mediata da Agrobacterium e l'inoculazione con graffio mediante stecchino vengono eseguite contemporaneamente.
1. Selezionare e inoculare i trasformanti positivi contenenti i vettori PVX-STTM in 50 mL di terreno LB liquido contenente 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina. Far crescere in un incubatore a 28 °C a 220 rpm per 16 h fino a OD₆₀₀ = 1,0.
2. Contemporaneamente, stendere le colonie positive di Agrobacterium su almeno due nuove piastre di LB contenenti 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina e far crescere a 28 °C per 1 giorno. Includere il vettore PVX-LIC come controllo e PVX-GFP per monitorare la diffusione del virus.
3. Raccogliere la coltura liquida di Agrobacterium mediante centrifugazione a 3.400 x g per 10 min a temperatura ambiente. Ri-sospendere le cellule di Agrobacterium con un volume uguale di buffer di infiltrazione (10 mM MgCl₂, 10 mM MES e 200 µM acetosiringone, pH = 5,6) e regolare a OD₆₀₀ = 1,0. Incubare a temperatura ambiente per 6 h.
4. Infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale di foglie completamente espanse utilizzando una siringa da 1 mL senza ago.
  1. Ruotare e tenere una foglia con una mano, quindi utilizzare un dito per sostenere la lamina fogliare dal lato adassiale nel sito di infiltrazione. Mantenere la siringa perpendicolare alla superficie della foglia con l'altra mano e infiltrare la coltura di Agrobacterium nel lato abassiale della lamina.
5. Prelevare la coltura di Agrobacterium dalle piastre di LB e graffiare la superficie del fusto nei primi uno o due internodi delle piante di patata infiltrate con uno stecchino. Graffiare delicatamente l'epidermide del fusto. Evitare di perforare completamente il fusto, poiché ciò potrebbe causare gravi danni alle piante.
Coltivare le piante infiltrate a 22 °C con un fotoperiodo di 16 h luce/8 h buio e un'intensità luminosa di 120 μmol/m²∙ s¹ in serra.
NOTA: I fenotipi causati dal silenziamento dell'RNAi micro (miRNA) compaiono di solito 2–4 settimane dopo l'inoculazione (Figura 1, Figura 2). Di norma, occorrono 10–20 giorni affinché il fenotipo VbMS si manifesti dopo l'infiltrazione. Il fenotipo VbMS dipende dalle proprietà del miRNA specifico e dei geni bersaglio, dalle condizioni di crescita e dalle varietà di patata.

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Risultati

Figura 1: Silenziamento virale mediato da STTM (VbMS) di miR165/166 nella varietà di patata tetraploide Katahdin. Fenotipi delle piante di patata (Katahdin) che esprimono il vettore di controllo PVX o PVX-STTM165/166. Le frecce magenta indi...