Preparazione di criosezioni di retina di topo per valutare la permeabilità retinica ai virus adeno-associati

In questo articolo

Abstract

Fonte: Vacca, O., et al. Utilizzo del virus adeno-associato come strumento per lo studio delle barriere retiniche in condizioni patologiche. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video illustra la procedura passo dopo passo per la preparazione di criosezioni retiniche di topo al fine di visualizzare la permeabilità del virus adeno-associato attraverso barriere retiniche compromesse.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica per animali competente.

Per sezioni criostatiche retiniche (Figura 1), dissezionare gli occhi enucleati per rimuovere il cristallino e la cornea, quindi fissare per immersione in paraformaldeide al 4% per 1 ora.
1. Crioproteggere gli occhi precedentemente fissati in soluzione di saccarosio al 10% per 1 ora a temperatura ambiente, quindi in saccarosio al 20% per un’altra ora a temperatura ambiente. Crioproteggere in soluzione di saccarosio al 30%, durante la notte a 4 °C. Congelare e incorporare le coppette oculari in una resina da inclusione come Cryo-matrix. Preparare sezioni criostatiche di 10 µm e montarle su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato, che migliorano l'adesione del tessuto durante la colorazione.
2. Permeabilizzare le sezioni con Triton X-100 0,1% in soluzione salina fosfato (PBS) pH 7,4 per 5 minuti. Lavare 2 volte in PBS e bloccare per 1 ora a temperatura ambiente in PBS contenente albumina sierica bovina (BSA) all’1% e Tween 20 allo 0,1%.

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Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo generale. Dopo la produzione del virus adeno-associato (AAV), le particelle vengono iniettate nel vitreo o nella vena peniena per anestetizzare topi adulti. Vengono eseguite immagini del f...