Preparazione di criosezioni di retina di topo per valutare la permeabilità retinica ai virus adeno-associati

Abstract

Fonte: Vacca, O., et al. Utilizzo del virus adeno-associato come strumento per lo studio delle barriere retiniche in condizioni patologiche. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video illustra la procedura passo dopo passo per la preparazione di criosezioni retiniche di topo al fine di visualizzare la permeabilità del virus adeno-associato attraverso barriere retiniche compromesse.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica per animali competente. 

1. Per sezioni criostatiche retiniche (Figura 1), dissezionare gli occhi enucleati per rimuovere il cristallino e la cornea, quindi fissare per immersione in paraformaldeide al 4% per 1 ora.
   1. Crioproteggere gli occhi precedentemente fissati in soluzione di saccarosio al 10% per 1 ora a temperatura ambiente, quindi in saccarosio al 20% per un’altra ora a temperatura ambiente. Crioproteggere in soluzione di saccarosio al 30%, durante la notte a 4 °C. Congelare e incorporare le coppette oculari in una resina da inclusione come Cryo-matrix. Preparare sezioni criostatiche di 10 µm e montarle su vetrini appositamente trattati per sezioni di tessuto congelato, che migliorano l'adesione del tessuto durante la colorazione.
   2. Permeabilizzare le sezioni con Triton X-100 0,1% in soluzione salina fosfato (PBS) pH 7,4 per 5 minuti. Lavare 2 volte in PBS e bloccare per 1 ora a temperatura ambiente in PBS contenente albumina sierica bovina (BSA) all’1% e Tween 20 allo 0,1%.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo generale. Dopo la produzione del virus adeno-associato (AAV), le particelle vengono iniettate nel vitreo o nella vena peniena per anestetizzare topi adulti. Vengono eseguite immagini del fondo oculare con una telecamera Micron III per monitorare l'espressione della proteina verde fluorescente (GFP). Il modello di espressione della GFP viene analizzato su sezioni criostatiche retiniche e retine appiattite grazie all'immunohistochimica e alle immagini confocali. Il passaggio dell'AAV attraverso la barriera emato-retinica (BRB) viene valutato mediante analisi di reazione a catena della polimerasi (PCR) su campioni di sangue provenienti da topi iniettati intravitrealmente o intraperitonealmente, al fine di rilevare la presenza della sequenza GFP, indicatore della presenza di particelle AAV nel torrente ematico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Resina di inclusione Cryomatrix	Thermo Scientific	6769006
Vetrini adesivi Superfrost plus	Thermo Scientific	10143352
Lente di ingrandimento binoculare SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Zoom 0,66 x 5 x LED con supporto epi e dia / Dissezione delle retine
Forbici a molla dritte - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissezione retinica