Trasferimento genico mediato da AAV per la visualizzazione della compromissione dell'integrità della membrana retinica

In questo articolo

Abstract

Fonte: Vacca, O., et al. Utilizzo del virus adeno-associato come strumento per lo studio delle barriere retiniche in condizioni patologiche. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video illustra il metodo di somministrazione genica mediata da AAV in una retina di topo transgenico, seguito da dissezione del tessuto e colorazione per valutare l'integrità della membrana limitante interna.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato etico per gli animali competente.

1. Immunoistochimica

Per preparati retinici in montaggio piatto (Figura 1), fissare gli occhi enucleati in paraformaldeide al 4% per 15 minuti per facilitare la dissezione.
1. In 15-30 minuti, dissezionare gli occhi per rimuovere la cornea e il cristallino. Separare la retina dall'epitelio pigmentato retinico (RPE) e dalla sclera tagliando intorno all'ora serrata e al nervo ottico. Immergere nuovamente in paraformaldeide al 4% per altri 30 minuti per fissare la retina e la proteina fluorescente nelle cellule retiniche transdotte (la fissazione non deve superare le 24 ore). Lavare per 5 minuti in PBS sterile, pH 7,4.
2. Sostituire il tampone salino fosfato (PBS) con il buffer di blocco (PBS contenente 1% di albumina sierica bovina (BSA), 2% di siero normale di capra o asino, 0,5% di Triton X-100) e incubare nel buffer di blocco per 4 ore a temperatura ambiente oppure a 4 °C durante la notte.
Incubare i tessuti con gli anticorpi primari nel buffer di blocco per 4 ore a temperatura ambiente oppure a 4 °C durante la notte. Lavare 3 volte con PBS.
NOTA: Gli anticorpi utilizzati sono i seguenti: anti-laminina (1/1.000) per etichettare la membrana limitante interna (ILM), anti-rodopsina clone 4D2 (1/500) per etichettare i bastoncelli, anti-glutamine sintetasi clone GS-6 (1/1.500) per etichettare le cellule di Müller, lectina di agglutinina di arachide (PNA) (1/40) per etichettare i coni.
Incubare i tessuti con una diluizione 1:500 di anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor nel buffer di blocco per 1 ora (sezioni crioistologiche) o 2 ore (preparati in montaggio piatto) a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Lavare 3 volte con PBS.
Eseguire incisioni di scarico sulla retina e montarla in piano su un vetrino con il lato dei fotoricettori o delle cellule gangliari retiniche (RGC) rivolto verso l'alto. Aggiungere un mezzo acquoso per il montaggio, applicare il coprioggetto e conservare a 4 °C.
Eseguire la microscopia confocale su un microscopio confocale a scansione laser. Acquisire le immagini sequenzialmente, riga per riga, per ridurre l'interferenza tra eccitazione ed emissione. Definire l'intervallo di passo in base al teorema del campionamento di Nyquist-Shannon. Utilizzare impostazioni di esposizione che minimizzino i pixel sovrasaturi nelle immagini finali. Elaborare immagini a 12 bit con FIJI, proiettare le sezioni Z su un singolo piano utilizzando l'intensità massima nella funzione Z-project e convertire infine in modalità colore RGB a 8 bit.

Risultati

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo generale. Dopo la produzione dell'AAV, le particelle vengono iniettate nel vitreo o nella vena peniena per anestetizzare i topi adulti. Vengono eseguite immagini del fondo oculare con una camera Micron III per seguire l'espressione della GFP (proteina verde fluorescente). Il profilo di espressione della GFP viene analizzato su sezioni criostatiche retiniche e su preparati retinici in montaggio piatto grazie all'immunohistochimica e alle immagini confocali. Il passaggio dell'AAV attraverso la barriera emato-retinica (BRB) viene valutato mediante analisi PCR su campioni ematici provenienti da topi iniettati intravitrealmente o intrapenialmente, al fine di rilevare la presenza della sequenza GFP, un indicatore della presenza di particelle AAV nel circolo sanguigno.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini adesivi Superfrost Plus	Thermo Scientific	10143352	Vetrini
Anti-laminina	Sigma	L9393	Anticorpo
Anti-rhodopsina clone 4D2	Millipore	MABN15	Anticorpo
Anti-glutammato sintetasi clone GS-6	Millipore	MAB302	Anticorpo
Anti-proteina acida fibrillare gliale	Dako	334	Anticorpo
Lettina PNA	Invitrogen	L32459	Sonda
anticorpi secondari coniugati con Alexa Fluor	Invitrogen		Anticorpo
Fluorsave reagent	Calbiochem	345789	Mezzo di montaggio
Colorante Evans Blue	Sigma	E2129	Colorante
Spettrofotometria del formammide	Sigma	295876-2L
Fluoresceina	Sigma	F2456	Colorante
Micron III	Phoenix Research Labs		Un sistema di microscopia basato su una telecamera a colori 3-CCD, un frame grabber e un software commerciale consente ai ricercatori di acquisire immagini delle retine di topo.
Binocolo ingranditore SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	Ingrandimento 0,66 x 5 x LED con supporto, illuminazione epiluminescenza e diascopia / Dissezione delle retine
Forbici a molla dritte - 8,5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	Dissezione della retina