Produzione e purificazione di particelle ricombinanti del virus dell'epatite B

Abstract

Fonte: Nishitsuji, H., et al. Sviluppo di un sistema reporter per il virus dell'epatite B per monitorare le fasi iniziali del ciclo di replicazione. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video illustra la produzione e la purificazione di particelle ricombinanti del virus dell'epatite B, consentendo preparazioni virali sicure e prive di replicazione per lo studio degli eventi iniziali dell'infezione e per applicazioni di screening ad alto rendimento di farmaci antivirali.

Protocollo

1. Produzione di HBV ricombinante (Hepatitis B Virus) che codifica per la proteina reporter

1. Preparazione delle cellule HepG2
   1. Preparare il mezzo di coltura cellulare (DMEM modificato di Dulbecco (Dulbecco's modified Eagle's medium) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 µg/ml di streptomicina e 100 U/ml di aminoacidi non essenziali).
   2. Piastrare 4 x 10⁶ cellule HepG2 (carcinoma epatocellulare umano G2) in una piastra da 10 cm rivestita di collagene con 10 ml di mezzo di coltura il giorno prima della trasfezione. Incubare le cellule HepG2 a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
      NOTA: Quando circa 4 x 10⁶ cellule HepG2 vengono piastrate in una piastra da 10 cm rivestita di collagene con 10 ml di mezzo di coltura, il giorno successivo risulteranno confluenti al 70-90%.
2. Trasfezione
   1. Trasfettare le cellule HepG2 con 5 µg di pUC1.2HBV delta epsilon15 (un plasmide di replicazione dell'HBV con una delezione nella sequenza epsilon) e 5 µg di pUC1.2HBV/NL15 utilizzando un reagente di trasfezione seguendo le istruzioni del produttore.
   2. Il giorno successivo, rimuovere il mezzo di coltura e aggiungere 10 ml di mezzo di coltura fresco.
   3. Una settimana dopo la trasfezione, trasferire il mezzo di coltura contenente l'HBV ricombinante in una provetta da 50 ml e procedere al passaggio 1.3.1. Aggiungere 10 ml di mezzo di coltura fresco alla piastra contenente le cellule trasfettate.
      NOTA: La produzione dell'HBV ricombinante viene mantenuta per 4 settimane. Il mezzo di coltura contenente l'HBV ricombinante può essere conservato a 4 °C per 1 mese.
3. Purificazione dell'HBV ricombinante
   1. Rimuovere i detriti cellulari dal mezzo di coltura contenente l'HBV ricombinante mediante centrifugazione (2.300 x g per 5 min).
   2. Filtrare il sopranatante attraverso un filtro membrana da 0,45 µm.
   3. Aggiungere un volume uguale di PEG al 26% / NaCl 1,5 M (polietilenglicole 6000: 130 g, NaCl (cloruro di sodio), 49 g, 1 ml di EDTA 0,5 M (acido etilendiamminotetraacetico) pH 8,0 e 5 ml di HEPES 1 M (N-2-idrossietilpiperazina-N'-2-etansolfonico) pH 7,6 in 500 ml) al mezzo di coltura contenente l'HBV ricombinante e mescolare delicatamente. Incubare tutta la notte a 4 °C.
   4. Centrifugare a 2.300 x g per 20 min a 4 °C.
   5. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 0,5 ml di TNE (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
   6. Rimuovere i detriti mediante centrifugazione a 2.300 x g per 5 min.
   7. Caricare 0,5 ml di TNE contenente l'HBV ricombinante su 0,8 ml di saccarosio al 20% in TNE.
   8. Centrifugare a 100.000 × g per 3 ore a 15 °C.
   9. Eliminare il più possibile del sopranatante, conservando il pellet. Risospendere in 1 ml di DMEM privo di siero per ogni 40 ml di mezzo di coltura iniziale.
   10. Incubare tutta la notte a 4 °C.
   11. Filtrare attraverso un filtro da 0,45 µm. Preparare aliquote da 0,5 ml e conservare a -80 °C.
       NOTA: Se si osserva una contaminazione da proteina reporter nel campione virale originale, purificare il virus mediante ultracentrifugazione su gradiente di densità di saccarosio al 5-30% in TNE a 100.000 x g per 2 ore, oppure mediante centrifugazione di equilibrio in densità di CsCl (cloruro di cesio) da 1,1 a 1,6 g/ml a 150.000 x g per 50 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente per saggio Nano-Glo Luciferasi	Promega	N1110
Soluzione mista Penicillina-Streptomicina	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Piatto da 100 mm rivestito con collagene	Iwaki	4020-010
Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polietilene glicole (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polietilene glicole (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
Soluzione di EDTA 0,5 mol/L	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, filtro da 0,45 μm in polieter solfone	Merck Millipore	SLHP033RS
Dietilsolfossido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Piastra da 96 pozzetti rivestita con collagene	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-