Visualizzazione di capsidi virali trattati termicamente mediante microscopia elettronica a trasmissione

Abstract

Fonte: Moore, M. D., et al. Metodi alternativi in vitro per la determinazione dell'integrità strutturale del capside virale. J. Vis. Exp.(2017).

In questo video viene illustrato come i capside virali purificati vengano sottoposti a trattamento termico, preparati e analizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per rivelare modifiche strutturali e danni indotti dal calore.

Protocollo

1. Preparazione del campione per TEM
   1. Reperire griglie con film di supporto in carbonio (in nichel) progettate per la TEM.
      NOTA: Consultare la struttura centrale per informazioni sui reagenti raccomandati e sulle modalità di manipolazione da utilizzare con il microscopio della struttura. Conservare le griglie in una scatola contenente un disidratante o in una camera a vuoto per ridurre al minimo l'esposizione all'umidità.
   2. Tagliare pezzi di carta da filtro di circa 5 cm x 5 cm. Reperire piastre di Petri in vetro e pinzette autocomprimenti adatte all'uso in microscopia.
   3. Tagliare un pezzo di pellicola in paraffina di circa 2,5 cm x 5 cm. Posizionarlo sul piano di lavoro.
   4. Trattamento termico dei capside del norovirus GII.4 Sydney
      1. Reperire la proteina del capside maggiore (VP1) purificata del norovirus umano GII.4 Sydney (Accession: JX459908) assemblata in capside. 
         NOTA: I capside utilizzati nello studio sono stati forniti gentilmente da R. Atmar (Baylor College of Medicine, Houston, TX).
      2. Diluire i capside in 10 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES) (pH 7,4) fino a un volume massimo di 15 µL in provette sigillate per reazione a catena della polimerasi (PCR). Assicurarsi che ogni provetta contenga almeno 600 ng di capside. Assicurarsi che vi siano 600 ng di capside per ogni combinazione trattamento-legante.
      3. Preriscaldare il termociclatore alla temperatura desiderata per il trattamento termico. 
         NOTA: Per questo protocollo, è stato scelto un trattamento a 68 °C per tempi diversi (0 - 25 min).
      4. Preriscaldare un termociclatore aggiuntivo a 4 °C per il raffreddamento immediato. Aggiungere le provette con la soluzione di capside al termociclatore per il tempo desiderato. Trasferirle immediatamente in un termociclatore preraffreddato a 4 °C per 5 minuti dopo il riscaldamento.
      5. Centrifugare brevemente per far sedimentare tutte le gocce sul fondo della provetta.
      6. Trasferire con una pipetta l'intera goccia di circa 15 µL di soluzione di capside trattata sulla pellicola in paraffina.
   5. Afferrare il bordo della griglia con le pinzette, chiudendole sul bordo per tenerla ferma, e posizionare la griglia con il lato in carbonio rivolto verso il basso sulla goccia di soluzione trattata. Lasciare incubare per 10 minuti in modo che i capside si attacchino alla griglia.
      1. In base alla purezza della preparazione di capside, aggiungere lavaggi con soluzione di HEPES 10 mM se necessario, sotto forma di gocce da 10-15 µL posizionate in fila dopo la goccia di capside trattata.
      2. Dopo 10 minuti, sollevare la griglia con la goccia. Posizionare la griglia quasi perpendicolarmente a un pezzo di carta da filtro per assorbire la goccia. Raccogliere la goccia di tampone HEPES da 10 - 15 µL con la griglia, mantenere per 30 s, quindi asciugare con un altro pezzo di carta da filtro per lavare.
   6. Posizionare una goccia da 15 µL di soluzione di acetato di uranile al 2% sulla pellicola in paraffina in un'area vuota.
      1. Raccogliere la goccia di acetato di uranile con la griglia e mantenere per 45 s. Asciugare l'acetato di uranile, assicurandosi di rimuovere la maggior parte della soluzione. Posizionare la griglia con il lato in carbonio rivolto verso l'alto su un pezzo di carta da filtro, facendo attenzione che la griglia non si "attacchi" all'umidità presente sulle pinzette. Posizionare il foglio di carta da filtro con la griglia in una piastra di Petri in vetro aperta.
         NOTA: Non utilizzare piastre di Petri in plastica, poiché le griglie verrebbero attratte elettrostaticamente e rimarrebbero attaccate alla piastra.
   7. Ripetere per tutti i trattamenti. Posizionare le mezze piastre di Petri con le griglie in un disidratatore per tutta la notte per farle asciugare prima dell'osservazione con la TEM.
   8. Consultare la struttura di microscopia dell'istituzione competente riguardo all'osservazione delle griglie preparate. Alcune strutture consentono all'utente di essere formato sull'uso dello strumento della struttura. Dettagli specifici riguardo alla configurazione e all'osservazione di un microscopio specifico esulano dallo scopo di questo articolo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Preparazione del campione per microscopia elettronica a trasmissione
Griglie in nichel per microscopia elettronica con film di supporto in carbonio	Ladd Research	10880-100
Pinzette autocomprimenti invertite per microscopia elettronica	Ted Pella	5372-NM
Carta da filtro qualitativa	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
Piastre di Petri in vetro	Sigma-Aldrich	BR455743
Soluzione stock di HEPES 100 mM (pH 7,2)	N/A	N/A
Acetato di uranile al 2%	N/A	N/A