Trasferimento genico mediato da batteriofagi in batteri spirochete

Abstract

Fonte: Eggers, C. H. Manipolazione genetica mediata da fagi del batterio a spirale Borrelia burgdorferi, agente della malattia di Lyme. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video illustra la trasduzione di spirochete Borrelia geneticamente modificate mediante batteriofagi non infettivi, precipitati con polietilene glicole, che trasportano un plasmide di resistenza alla kanamicina. Dopo l'incubazione con i batteri, la coltura viene seminata su un mezzo supplementato con antibiotico. Solo le cellule che ricevono il plasmide sopravvivono e formano colonie. Queste colonie vengono quindi selezionate e amplificate in un mezzo liquido contenente antibiotico per stabilire una popolazione batterica stabile portatrice del plasmide, da utilizzare in applicazioni successive.

Protocollo

1. Saggio di trasduzione dopo la precipitazione con PEG (polietilene glicole) del batteriofago φBB-1

1. Preparare B. burgdorferi colture da utilizzare come riceventi nei saggi di trasduzione. Sulla base della densità determinata, calcolare il volume di coltura del ricevente necessario per ottenere 15 mL di 1 × 107 spirochete·mL−1
2. Centrifugare il volume della coltura a 6.000 x g per 10 minuti. Decantare il sopranatante e risospendere il pellet in 14,5 mL di BSK (Barbour-Stoenner-Kelly) fresco.
3. Aggiungere ≤500 µL di campione di fago precipitato con PEG alla coltura del clone ricettore. Mescolare bene e incubare a 33 °C per 72-96 h.
   NOTA: La quantità di fagi recuperata durante la precipitazione con PEG può variare, a seconda di diversi fattori. Tuttavia, da una coltura di 15 mL dell'indotto B. burgdorferi ceppo CA-11.2A, 500 µL contiene tipicamente da 50 a 1.000 fagi vitali28. Volumi di recupero dei fagi ≥500 µL influire negativamente su B. burgdorferi crescita, probabilmente dovuta all'aumento del rapporto tra SM (mezzo di sospensione) e BSK.
4. Eseguire la selezione dei trasduttori mediante piastramento in fase solida dopo il mescolamento con fagi precipitati con PEG.

2. Selezione dei trasduttori

NOTA: La semina su fase solida dei possibili trasduttori viene eseguita utilizzando una modifica a singolo strato del protocollo. Le colonie di B. burgdorferi crescono all'interno dell'agar, quindi per la selezione dei trasduttori mediante semina su fase solida, i campioni devono essere aggiunti al mezzo mentre si preparano le piastre. Questa tecnica potrebbe risultare efficace anche per la selezione dei trasduttori, ma non è ancora stata provata a tale scopo.

1. Determinare il numero di piastre necessarie per la selezione dei trasduttori in base al numero di campioni provenienti dai saggi di trasduzione e ai controlli da seminare.
   NOTA: Di solito vengono preparate due piastre per campione: una corrispondente a circa il 10% del volume della coltura e una che include il resto della coltura. Inoltre, preparare piastre da utilizzare come controlli negativi per verificare singolarmente che la preparazione di fagi e/o le linee cellulari parentali utilizzate come donatore e ricevente non crescano in presenza dell'antibiotico(i) impiegato(i) durante la selezione. Si consiglia anche di preparare materiale per almeno due piastre aggiuntive. Ad esempio, se il numero di campioni e controlli da seminare è otto, preparare materiale sufficiente per 10 piastre.
2. Preparare le soluzioni per la semina come descritto di seguito.
   NOTA: Ogni piastra sarà di 30 mL, costituita da 20 mL di BSK 1,5x per la semina e 10 mL di agarosio al 2,1% (rapporto 2:1). Questo produrrà una piastra con concentrazioni finali di BSK 1x e agarosio 0,7%. Ad esempio, per 10 piastre, preparare un volume totale di miscela per la semina pari a 300 mL, costituito da 200 mL di BSK 1,5x e 100 mL di agarosio al 2,1%.
   1. Preparare 1 L di BSK 1,5x utilizzando le quantità di ciascun componente elencate per il BSK 1,5x. Conservare come descritto per il BSK 1x.
   2. Preparare agarosio al 2,1% in acqua e sterilizzare in autoclave. Utilizzare la soluzione di agarosio fresca o conservarla a temperatura ambiente. Se conservata a temperatura ambiente, riscaldare in microonde con il coperchio allentato fino a completa fusione prima della semina.
   3. Determinare il volume di antibiotico(i) necessario per raggiungere la concentrazione appropriata in base all'intera miscela per la semina.
      NOTA: Se il volume totale della soluzione finale per la semina è 300 mL, mescolare 200 mL di BSK 1,5x e una quantità di antibiotico sufficiente a garantire che l'intero volume di 300 mL abbia la corretta concentrazione finale di antibiotico. Se il donatore e il ricevente nel saggio di trasduzione possiedono geni di resistenza a diversi antibiotici, la miscela per la semina deve contenere entrambi gli antibiotici. Se il fago precipitato con PEG dal donatore codifica un marcatore di resistenza antibiotica e il ricevente non ne possiede alcuno, la miscela per la semina deve contenere un solo antibiotico.
3. In base al numero di piastre da preparare, trasferire la quantità appropriata di BSK 1,5x e antibiotico(i) in una bottiglia sterile di dimensioni sufficienti a contenere l'intera miscela per la semina. Portare all'equilibrio in un bagnomaria a 56 °C per almeno 15 min.
4. Portare all'equilibrio l'agarosio fuso proveniente dall'autoclave o dal microonde in un bagnomaria a 56 °C per almeno 15 min.
5. Dopo l'equilibrio, aggiungere la quantità determinata di agarosio al 2,1% alla bottiglia contenente il BSK 1,5x (con antibiotico) e riportare la soluzione per la semina nel bagnomaria a 42 °C per 10-15 min.
   NOTA: Temperature più elevate possono danneggiare o uccidere gli spirochete36. Se si utilizza lo stesso bagnomaria di cui sopra, raffreddare l'acqua a 42-45 °C prima di avviare il cronometro per l'equilibrio. Non lasciare che la soluzione per la semina rimanga a 42 °C per più di 20 min, altrimenti inizierà a solidificarsi durante la semina.
6. Durante l'equilibrio, preparare i campioni di B. burgdorferi da seminare. Trasferire la quantità da seminare in un tubo conico sterile da 50 mL
7. Se si semina un volume inferiore a 1,5 mL (<5% del volume finale della piastra di 30 mL), trasferire il campione nel nuovo tubo e aggiungere direttamente la miscela per la semina al campione durante la semina.
   1. Per volumi maggiori, trasferire il volume desiderato di coltura nel nuovo tubo e centrifugare a 6.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Decantare tutto tranne 100-500 µL del soprannatante e utilizzare il resto per risospendere completamente il pellet prima della semina.
   2. Per le piastre di controllo dopo co-coltura, aggiungere ≥107 cellule delle linee cellulari donatrici o riceventi in tubi conici sterili da 50 mL. Se il volume supera 1,5 mL, centrifugare e risospendere il pellet. Se è stato eseguito un saggio di trasduzione utilizzando il fago precipitato con PEG, aggiungere inoltre al clone ricevente 100-250 µL del campione di fago in un tubo conico sterile da 50 mL per la semina.
8. Dopo che la soluzione per la semina ha raggiunto l'equilibrio a 42-45 °C per 10-15 min, trasferire 30 mL della soluzione in un tubo contenente il campione appropriato; dispensare immediatamente la miscela per la semina e il campione in una piastra etichettata. Ripetere utilizzando una pipetta nuova per ogni campione da seminare.
9. Lasciare solidificare le piastre per 15-20 min, quindi posizionarle in un incubatore a 33 °C con aggiunta di 5% di CO₂. Non capovolgere le piastre per almeno 48 h dopo la preparazione.
10. In base al genotipo del clone ricevente, verificare che le colonie compaiano all'interno dell'agarosio sulle piastre di selezione dopo 10-21 giorni di incubazione. Scegliere almeno 5-10 colonie che crescono sulla piastra in presenza di entrambi gli antibiotici utilizzando una pipetta borosilicata da 5,75 pollici con tappo di cotone sterile e inocularle in 1,5 mL di BSK 1x con il (i) antibiotico(i) appropriato(i).
11. Coltivare le colonie inoculate a 33 °C per 3-5 giorni o fino a quando non raggiungono una densità di circa 20-40 spirochete per campo a 200x di ingrandimento mediante microscopia in campo scuro.
    NOTA: Dopo la selezione, gli spirochete possono essere congelati per la conservazione a lungo termine a −80 °C mescolando un volume uguale di coltura con una miscela di 60% glicerolo e 40% BSK 1x sterilizzata per filtrazione attraverso un filtro da 0,22 µm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tube centrifuge coniche da 15 mL (polipropilene)	USA Scientific	5618-8271
Mitomicina C	Thermo Fisher Scientific	BP25312	ATTENZIONE: potenziale cancerogeno; utilizzare esclusivamente in una cappa chimica
Pipette di Pasteur da 5,75" (con tappo di cotone/vetro borosilicato/non sterile)	Thermo Fisher Scientific	13-678-8A	Autoclavare prima dell'uso
Tube centrifuge coniche da 50 mL (polipropilene)	USA Scientific	1500-1211
Etilene alcolico assoluto
Eritromicina	Research Products International Corp	E57000-25.0
Soluzione reagente di Gentamicina	Gibco	15750-060
Glucosio (Destrosio anidro)	Thermo Fisher Scientific	BP350-500
HEPES	Thermo Fisher Scientific	BP310-500
Solfato di Kanamicina	Thermo Fisher Scientific	25389-94-0