Trasferimento genico in organoidi intestinali di topo mediante vettori lentivirali

Abstract

Fonte: Van Lidth de Jeude, J. F., et al. Protocollo per la trasduzione lentivirale e l'analisi successiva di organoidi intestinali. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video descrive la trasduzione lentivirale di organoidi intestinali di topo a partire da una struttura simile a un cripto che contiene una sospensione. Utilizzando una matrice della membrana basale come impalcatura e mezzi supplementati con fattori di crescita, vengono introdotti vettori lentivirali per consentire l'integrazione stabile del gene

Protocollo

Trasduzione Lentivirale di Organoidi

Giorno 0:

1. Dividere un pozzetto pieno di organoidi di 0,95 cm² due giorni prima della trasduzione in un nuovo pozzetto, mirando a ottenere circa 50 organoidi di piccole dimensioni. Dividere gli organoidi (Figura 1A, B).
2. Integrare il mezzo di coltura per organoidi con 10 µM di Chir99021 e 10 mM di nicotinamide per ottenere cripte cistiche iperproliferative (Figura 1C).
   NOTA: Le cripte cistiche si sviluppano al meglio quando gli organoidi appena divisi vengono coltivati in presenza di Chir99021.

Giorno 2:

3. Raccogliere gli organoidi aspirando e dispensando il matrigel e il mezzo con una micropipetta p1000, perturbando così la miscela. Collocare la miscela in un tubo da 15 mL.
4. Perturbare ulteriormente utilizzando una pipetta di Pasteur in cui l'apertura distale è stata ridotta per fusione. Centrifugare gli organoidi per formare il pellet per 5 min a 100 x g.
   NOTA: A seconda delle dimensioni della centrifuga, utilizzare una velocità diversa. È necessario determinare la velocità esatta alla quale gli organoidi disgregati si separano dalla miscela.
5. Rimuovere il soprannatante e aggiungere 500 µL di tripsina 1x preriscaldata (simile alla tripsina allo 0,25%). Ri-sospendere gli organoidi nella tripsina e incubare per 3 min in un bagno termico a 37 °C.
6. Inattivare la tripsina aggiungendo 3,5 mL di mezzo di coltura per linee cellulari [Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino (FCS), 1% di penicillina/streptomicina e glutammina]. Centrifugare per 5 min a 500 x g.
7. Rimuovere il soprannatante in modo da lasciare un pellet in circa 20 µL di mezzo. Trasferire gli organoidi in questa piccola quantità residua di mezzo in una pozzetta di una piastra a 48 pozzetti.
8. Aggiungere lentivirus ad alto titolo nel mezzo di trasduzione, ri-sospendere e procedere al passaggio 3.10. Da applicare in caso di bassa efficacia di trasduzione.
   NOTA: Per una trasduzione efficiente, di solito si aggiunge un'aliquote di 250 µL di lentivirus ad alto titolo a una pozzetta di organoidi. Questo corrisponde al 50% di tutto il lentivirus raccolto da una singola produzione.
9. Opzionale: per aumentare l'efficacia di trasduzione, eseguire una spinoculazione posizionando la piastra a 48 pozzetti contenente gli organoidi in una centrifuga preriscaldata a 32 °C e ruotare a 600 x g per 1 ora.
10. Collocare la miscela organoide-virus nell'incubatore di coltura e incubare per 1 ora a 37 °C nell'incubatore di coltura per consentire la trasduzione.
11. Opzionale: per aumentare ulteriormente l'efficacia di trasduzione, incubare gli organoidi per ulteriori 3 ore a 37 °C nell'incubatore di coltura.
12. Aggiungere 1 mL di mezzo di coltura per organoidi e ri-sospendere la miscela organoide-virus, trasferire in un tubo da microcentrifuga e centrifugare in una microcentrifuga per 5 min a 850 x g per ottenere il pellet degli organoidi.
13. Rimuovere il soprannatante e ri-sospendere il pellet in 20 µL di Matrigel freddo. Poiché il materiale si solidifica quando si riscalda, utilizzare punte di pipetta raffreddate aspirando e dispensando diverse volte PBS freddo.
14. Posizionare la goccia al centro di una pozzetta in una piastra a 48 pozzetti e incubare nell'incubatore di coltura a 37 °C per 15 min per farla solidificare.
15. Dopo 15 min, aggiungere con attenzione 250 µL di mezzo di coltura per organoidi integrato con 10 mM nicotinamide, 10 µM Chir99021 e 10 µM Y27632. Piccoli frammenti di organoidi disgregati formeranno organoidi cistici di piccole dimensioni entro 24 ore.

Giorno 5:

16. Aggiornare il mezzo e integrare con una selezione di antibiotici (per la puromicina, utilizzare 4 µg/mL).

Giorno 7:

1. Sostituire il mezzo con mezzo di coltura standard per organoidi, integrato con antibiotico di selezione.
   NOTA: La gemmazione sarà completa da 2 a 3 settimane dopo la rimozione di Chir99021. Dopo la selezione, gli organoidi possono essere coltivati senza antibiotici di selezione.

Risultati

Figura 1: Schema della produzione di lentivirus per la trasduzione di organoidi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polietilene imina	Polysciences	23966-2
Mezzo DMEM	Lonza	BE12-614F
Siero fetale bovino	Lonza	DE14-801F
Penicillina-streptomicina	Invitrogen	15140-122
Glutammina	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
DMEM-F12 avanzato	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-acetil cisteina	Sigma	A9165-1G
Egf murino	Invitrogen	PMG8045
Hepes 1 M	Invitrogen	15630-056
Glutamax 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
Polybrene	Sigma	107689
Nicotinamide	Sigma	N0636
Tripsina	Lonza	BE02-007E