Rilevazione dell'attivazione della via SMAD tramite trasduzione con doppio adenovirus

Abstract

Fonte: Chen, H., et al.. Imaging in tempo reale di cellule vive del TGF-β/Attivazione della via di segnalazione di Smad3 in vitro e in vivo mediante un sistema di reporter virale ad adenovirus. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video illustra un metodo per studiare l'attivazione della via di segnalazione SMAD in cellule tumorali del seno mediante infezione doppia con adenovirus. Un virus trasporta un gene GFP costitutivamente espresso, mentre l'altro contiene un reporter RFP sotto un promotore sensibile a SMAD. Dopo la stimolazione con TGF-beta, le proteine SMAD vengono attivate, formando un complesso che induce l'espressione di RFP. Il rilevamento di segnali doppi in cellule vive conferma l'attivazione della via di segnalazione.

Protocollo

1. Trasduzione con doppio adenovirus in singole cellule vive

1. Sezionare 1,0 - 1,5 x 10⁵ cellule MDA-MB-231 con 500 μL di mezzo di coltura Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) contenente il 5% di siero bovino fetale (FBS) in ogni pozzetto di una piastra a 12 pozzetti (confluenza cellulare del 35%, 2 pozzetti in totale).
2. Infettare le cellule con 75 μL di vettore adenovirale Ad-CMV-GFP (titolo = 5 x 10⁹ PFU/mL) e 7,5 μL di vettore adenovirale Ad-CAGA12-Td-Tom (titolo = 5 x 10¹⁰ PFU/mL) per ottenere una molteplicità di infezione (MOI) di 2.500, in grado di raggiungere una positività all'infezione del 100%.
3. Trattare le cellule con o senza 0,25 μL di fattore di crescita trasformante-beta (TGF-β) per pozzetto (10 mg/mL in soluzione madre, 5 ng/μL come concentrazione finale) immediatamente dopo l'infezione con adenovirus.
4. Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 °C con 10% di CO₂ per 24 h.
5. Acquisire immagini delle cellule vive mediante microscopio a fluorescenza in contrasto di fase. Eccitare la proteina verde fluorescente (GFP) a 470 nm e la proteina Td-Tomato a 554 nm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	ThermoFisher	1881024	Riscaldare in bagnomaria a 37 °C prima dell'uso
Siero bovino fetale	Scientifix Life	FBS500-S	Inattivare termicamente prima dell'uso
TGF-β1 umano ricombinante	PEPROTECH	100-21	Aliquotare in acqua deionizzata per ottenere una concentrazione finale di 10 mg/mL
Microscopia a contrasto di fase con fluorescenza	OLYMPUS	IX50
MDA-MB-231	ATCC	CRM-HTB-26
Soluzione			Composizione
FBS-DMEM			5% FBS inattivato termicamente; 10 μg/mL penicillina; 100 μg/mL streptomicina