Imaging a fluorescenza multiplex di acidi nucleici virali e proteine in linfociti umani infetti

Abstract

Fonte: Shah, R., et al. Imaging fluorescente multiplexato a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare l'infezione da HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e influenza. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra la visualizzazione simultanea del DNA, dell'RNA e della proteina del capside dell'HIV-1 in linfociti umani infetti mediante ibridazione con DNA ramificato e immunofluorescenza, consentendo un'analisi dettagliata delle fasi di replicazione virale all'interno di singole cellule.

Protocollo

1. Immunoistochimica proteica: per etichettare la/e proteina/e di interesse

1. Decantare il PBS (soluzione salina fosfato-tampone) e aggiungere 200 µL di buffer bloccante (1% p/v BSA (albumina sierica bovina), 10% v/v FBS (siero fetale bovino) in PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST) sul coverslip. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT).
2. Decantare il buffer bloccante e applicare 200 µL di anticorpo primario diluito in PBST + 1% p/v BSA. Incubare per 1 h a temperatura ambiente (RT).
3. Lavare il vetrino due volte con PBST per 10 min a temperatura ambiente (RT) con agitazione.
4. Applicare un anticorpo secondario a scelta per 1 h a temperatura ambiente (RT) in PBST + 1% p/v BSA.
5. Lavare il vetrino con PBST per 10 min a temperatura ambiente (RT) con agitazione.

2. Colorazione nucleare: controcolorare i nuclei a seguito della immunocolorazione

1. Rimuovere delicatamente il PBST e aggiungere DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo) o un colorante nucleare a scelta per 1 min a temperatura ambiente (RT).
2. Lavare il vetrino due volte con PBS per 10 min a temperatura ambiente con agitazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-HCV NS5a	Abcam	ab13833	Mouse monoclonal; funziona con i genotipi 1a, 1b, 3 e 4 dell'HCV
Anticorpo monoclonale anti-HIV-1 p24	NIH AIDS Reagent Program	3537
Anticorpo anti-Mov10	Abcam	ab80613	Policlonale da coniglio
Albumina sierica bovina			Reagente bloccante per immunostaining
Mezzo cellulare con integratori			Mezzo appropriato per il modello cellulare
Coverslip
DAPI	ACD Bio		Colorante nucleare (kit RNAscope di ACD Bio)
Phosphate buffered saline di Dulbecco (PBS 1X)	Gibco	14190250	Senza calcio e magnesio
Siero fetale bovino (FBS)			Utilizzare un FBS specifico in base al siero in cui è stato prodotto l'anticorpo secondario (ad es. FBS di capra)
Lame da microscopio Fisherbrand Colorfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	Prerepurate
Lame
Tween-20			Per tampone di ibridazione del DNA e PBS-T