Purificazione di intasomi di Prototype Foamy Virus mediante cromatografia a esclusione dimensionale

Abstract

Fonte: Mackler, R. M., et al. Assemblaggio e Purificazione di Intasomi del Virus della Mucose Bovina. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video illustra la purificazione degli intasomi del virus della foamy prototipico (PFV) da una sospensione mista proteina-DNA mediante estrazione con sale e cromatografia di esclusione molecolare, ottenendo complessi attivi per analisi successive.

Protocollo

1. Solubilizzazione dell'intasoma

1. Preparare due punte pipetta a grande apertura rimuovendo 2-4 mm dall'estremità di una punta da 200 µL con una nuova lametta o lama da bisturi su una superficie pulita.
   NOTA: Le punte verranno utilizzate al passaggio 1.3 e 1.5.
2. Rimuovere il tubo da dialisi dal tampone di dialisi. Per evitare la diluizione del campione di intasoma con il tampone di dialisi che potrebbe rimanere all'estremità del tubo vicino alla clip, utilizzare una micropipetta con una punta piccola per rimuovere qualsiasi eccesso di tampone di dialisi. Rimuovere la clip da un'estremità del tubo da dialisi.
3. Utilizzare una punta pipetta a grande apertura del passaggio 1.1 per trasferire il campione, inclusa la precipitazione presente all'interno del tubo da dialisi, in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio. 
   NOTA: Il volume totale del materiale recuperato è tipicamente di circa 140 µL.
4. Il campione con precipitato è a 200 mM NaCl; aumentare la concentrazione salina fino a una concentrazione finale di 320 mM NaCl aggiungendo il volume appropriato di una soluzione madre di NaCl 5 M. Ad esempio, per un campione di 150 µL, aggiungere 3,9 µL di NaCl 5 M e 1,1 µL di ddH₂O per un volume finale di 155 µL. Trasferire il contenitore con ghiaccio e campione in una stanza fredda a 4 ˚C.
5. Utilizzare una punta pipetta a grande apertura del passaggio 1.1 per risospendere e solubilizzare il precipitato mediante pipettaggio. Ripetere ogni 20 minuti per almeno 1 ora. Osservare che la maggior parte del precipitato dovrebbe andare in soluzione.
   NOTA: Il pipettaggio per risospendere il precipitato può essere interrotto quando è evidente che il precipitato non si riduce più in modo apprezzabile tra un punto temporale e l'altro. Quando il DNA virale (vDNA) non è marcato o è marcato internamente, il precipitato si riduce di circa il 90% in base all'ispezione visiva. Nel caso di vDNA marcato all'estremità con Cy5, il precipitato si riduce solo di circa il 20%; la maggior parte del precipitato con vDNA marcato all'estremità con fluoroforo non si solubilizzerà. La quantità di precipitato effettivamente solubilizzata è variabile e deve essere determinata empiricamente.

2. Purificazione dell'Intasoma

1. Preparare 250 mL di tampone di eluizione per cromatografia ad esclusione molecolare (SEC) (20 mM Bis-tris propane, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerolo). Filtrare sterilmente il tampone con un filtro da 0,2 µm e conservarlo a 4 ˚C.
   NOTA: Tutti i passaggi di purificazione vengono eseguiti in una stanza fredda a 4 ˚C.
2. Equilibrare una colonna SEC in agarosio reticolato (diametro = 10 mm; lunghezza = 300 mm; volume della fase stazionaria = 24 mL; volume del campione = 25 - 500 µL; pressione massima = 1,5 MPa; limite di esclusione = 4 x 10⁷ Da; separa pesi molecolari compresi tra 5 e 5.000 kDa, vedere la Tabella dei Materiali) con il tampone SEC alla velocità di flusso di 0,4 mL/min.
   NOTA: Questa purificazione può essere adattata a colonne diverse di esclusione molecolare, purché siano in grado di separare efficacemente 300 kDa da 44 kDa, come Superose 12 10/300 GL o Superose 6 Increase. Superose 12 10/300 GL ha una risoluzione inferiore, con conseguente maggiore sovrapposizione dei picchi. Al contrario, Superose 6 Increase ha una risoluzione superiore e offre una separazione migliore.
3. Centrifugare il campione di intasoma in un microcentrifugo a 14.000 x g per 10 minuti a 4 ˚C per formare il pellet di qualsiasi precipitato residuo. Rimuovere con attenzione il soprannatante. Caricare il soprannatante su un loop di iniezione da 200 µL (tubo capace di contenere circa 200 μL). Applicare il campione sulla colonna SEC.
   NOTA: Volumi di carico più piccoli consentono una risoluzione maggiore tramite SEC.
4. Eluire con 25 mL di tampone SEC e raccogliere 95 frazioni da 270 µL. Osservare che il cromatogramma SEC mostra tre picchi di A₂₈₀/A₂₆₀ (Figura 1).
   NOTA: Il primo dovrebbe corrispondere a un aggregato (~9,0 - 11,5 mL di eluizione), seguito dal picco dell'intasoma tetramero di PFV (~12,0 - 14,75 mL di eluizione) e dal picco del monomero di PFV IN con vDNA libero (~15,0 - 18,0 mL).

Risultati

Figura 1: Cromatogramma di esclusione molecolare. Un assemblaggio dell'intasoma di PFV è stato separato mediante una colonna SEC in agarosio. Questa colonna permette la separazione dell'aggregato (1), dell'intasoma di PFV costituito da un tetramero di IN di PFV e due vDNA (2) e dell'IN monomerico di PFV e vDNA (3). In questo esempio era presente vDNA con un marcatore fluoroforo Cy5 interno, rilevato mediante eccitazione a 650 nm. L'asse y indica la densità ottica (OD) in unità di assorbanza milli (mAU).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Oligomeri di DNA	IDT	N/A	Oligonucleotidi di DNA su misura
NaCl	P212121	RP-S23020
BIS-TRIS propane, >=99,0% (titolazione)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
Glicerolo	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Punte per caricamento gel, 1 - 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Lama di rasoio; a spigolo singolo; 100/Pk.; Confezione da 100	Fisher Scientific	12-640
Clip per tubi da dialisi	Spectrum Labs	132734
Tubo da dialisi 6-8 kDa, 10 mm	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201