Ottenimento dell'RNA virale per l'analisi mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)

Abstract

Fonte: Suzuki, Y., et al. Misurazione dell'RNA del virus della dengue nel supernatante di coltura di cellule infette mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video illustra la procedura per la preparazione di campioni virali da analizzare mediante PCR quantitativa (Polymerase chain reaction). I campioni virali e gli standard di RNA vengono diluiti in serie, trattati con un buffer contenente proteinasi K e incubati a temperature controllate per liberare l'RNA. L'RNA processato viene quindi stabilizzato e conservato per la quantificazione dei livelli di RNA virale.

Protocollo

1. Elaborazione dei campioni virali per RT-qPCR (reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale)

NOTA: I passaggi da 1.1 a 1.3 devono essere eseguiti all'interno di una cappa a sicurezza biologica. In particolare, la manipolazione del surnatante di coltura contenente un virus infettivo deve avvenire in un ambiente di livello di sicurezza biologica 2 (o superiore).

1. Mescolare 199 μL di un buffer di lavorazione e 1 μL di proteinasi K priva di nucleasi.
2. Diluire in serie l'RNA sintetizzato della regione 3’UTR (regione non tradotta) del virus della dengue (DENV) in rapporto 1:10 per ottenere uno standard di RNA compreso tra 5 x 10⁹ e 5 x 10³ copie/μL, utilizzando mezzo di coltura cellulare (ad esempio DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) integrato con siero fetale bovino al 10% e antibiotici [DMEM/siero fetale bovino al 10%]) contenente 40 unità/mL di inibitore della RNasi.
3. Mescolare 5 μL del surnatante di coltura di cellule infettate da DENV e lo standard di RNA della regione 3’UTR del DENV con 5 μL di soluzione di buffer di lavorazione/proteinasi K, utilizzando strip PCR da 8 provette o una piastra PCR a 96 pozzetti. Come controllo senza stampo (NTC), mescolare 5 μL di mezzo di coltura cellulare (ovvero senza inclusione di virus) con 5 μL della soluzione di buffer di lavorazione/proteinasi K.
4. Dopo una breve centrifugazione, incubare i campioni in un termociclatore alle seguenti condizioni: 1 ciclo (25 °C per 10 minuti e 75 °C per 5 minuti).
NOTA: I campioni processati possono essere conservati a 4 °C se l'analisi PCR in tempo reale viene eseguita nello stesso giorno. Per la conservazione a lungo termine, i campioni devono essere conservati a -80 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Termociclatore SimpliAmp	Thermo Fisher Scientific	A24811	Strumento termociclatore comparabile, ma le condizioni del ciclo PCR devono essere ottimizzate.
Inibitore ricombinante di RNasi	Takara Bio. Inc	2313A	40 unità/μL
Kit RNeasy Mini	Qiagen	74104	È possibile utilizzare un kit comparabile per la purificazione dell'RNA.
Proteasi K	Nacalai Tesque	15679-06	>600 unità/mL. È possibile utilizzare un reagente comparabile.
Piastra reazione 96 pozzetti MicroAmp Fast Optical, 0,1 mL	Thermo Fisher Scientific	4346907	È possibile utilizzare una piastra o provetta comparabile a seconda dello strumento di PCR in tempo reale, ma le condizioni del ciclo PCR devono essere ottimizzate.