Raccolta di particelle di virus dell'epatite E da cellule di carcinoma epatocellulare umano

Abstract

Fonte: Meister, T. L., et al. Un Modello di Coltura Cellulare per la Produzione di Ceppi di Virus dell'Epatite E ad Alto Titolo. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video illustra il processo di isolamento delle particelle del virus dell'epatite E (HEV) da cellule di carcinoma epatocellulare umano trasfettate. Le particelle virali extracellulari vengono raccolte dai soprannatanti filtrati, mentre le particelle intracellulari vengono rilasciate sottoponendo le cellule a cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Il lisato viene centrifugato e il soprannatante contenente le particelle di HEV viene frazionato in aliquote e conservato a una temperatura ultra-bassa per un uso futuro.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule HepG2 per la produzione di virus dell'epatite E derivato da colture cellulari (HEVcc)
NOTA: Per evitare contaminazioni, la preparazione delle cellule, l'elettroporazione, l'infezione, il raccolto e la fissazione delle cellule sono state eseguite in condizioni sterili in un impianto di livello di sicurezza biologica 2. I passaggi di incubazione a 37 °C che coinvolgono le cellule sono stati effettuati in un incubatore con 5% di CO₂.

1. Per preparare le cellule HepG2 per la produzione di HEVcc (Figura 1), seminare le cellule in mezzo completo di Dulbecco (DMEM) (vedere Tabella 1) su una piastra da coltura da 15 cm rivestita con collagene (vedere Tabella 1, filtrare sterilmente la soluzione di collagene in PBS tampone fosfato salino acido acetico attraverso una membrana da 0,2 µm prima dell'aggiunta del collagene). Incubare a 37 °C fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%.
   NOTA: Ogni piastra da 15 cm contenente cellule al 90% confluenti produrrà un numero sufficiente di cellule per fino a 4 elettroporazioni.
2. Rimuovere delicatamente il mezzo dalla piastra e lavare le cellule una volta con 10 mL di PBS 1x. Tripasinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina-EDTA 0,05% sulle cellule e incubare a 37 °C fino al completo distacco. Ri-sospendere le cellule in 10 mL di mezzo DMEM completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. Determinare il numero totale di cellule.
3. Poiché ogni elettroporazione richiede 5 x 10⁶ cellule, trasferire il volume appropriato in un nuovo tubo da 50 mL e portare a un volume minimo di 35 mL con PBS 1x. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti e scartare con attenzione il soprannatante senza disturbare il pellet cellulare.
4. Lavare nuovamente le cellule con 35 mL di PBS 1x a 200 x g per 5 minuti. Posizionare le cellule sul ghiaccio e non rimuovere ancora il PBS 1x, per mantenere le cellule in sospensione.

2. Elettroporazione di cellule HepG2

1. Per l'elettroporazione delle cellule HepG2 (Figura 2), preparare 400 µL di Cytomix completo per ogni elettroporazione aggiungendo 384 µL di Cytomix (vedere Tabella 1) con ATP 2 mM e glutathione 5 mM. Preparare al momento dell'uso e porre immediatamente sul ghiaccio.
   NOTA: È fondamentale eseguire correttamente e rapidamente i passaggi seguenti. Assicurarsi quindi che tutto sia preparato adeguatamente.
2. Rimuovere con attenzione 1x PBS senza disturbare il pellet cellulare ottenuto al passaggio 4.4. Sospendere 5 x 10⁶ cellule in 400 µL di Cytomix completo e aggiungere 5 µg di RNA. Trasferire la soluzione in una cuvetta da 4 mm ed eseguire un impulso a 975 µF, 270 V per 20 ms mediante un sistema di elettroporazione.
   1. Dopo l'elettroporazione, trasferire le cellule il più rapidamente possibile con una pipetta di Pasteur in 11 mL di DMEM completo per ogni elettroporazione.
      NOTA: Per verificare che l'RNA sia stato correttamente trasfettato nelle cellule HepG2, verrà effettuato un controllo di trasfezione (TC). I tassi di trasfezione attesi variano tra il 40 e il 60% di cellule positive per ORF2.
3. Trasferire 10 mL di cellule elettroporate in una piastra da coltura da 10 cm rivestita con collagene. Aggiungere 1,3 x 10⁵ cellule elettroporate (300 µL) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita con collagene contenente un cover slip (che verrà utilizzato successivamente come controllo di trasfezione). Distribuire le cellule in modo uniforme e incubare a 37 °C.
   1. Dopo 24 h, sostituire il mezzo nella piastra da 10 cm con 10 mL di DMEM completo fresco. Non sostituire il mezzo nel controllo di trasfezione. Incubare per ulteriori 6 giorni a 37 °C.

3. Raccolta di HEV (HEVcc) intracellulare ed extracellulare derivati da colture cellulari

1. Per raccogliere le particelle virali extracellulari di HEVcc (Figura 3), filtrare il soprannatante ottenuto dalla piastra da 10 cm dopo 6 giorni attraverso una membrana da 0,45 µm per rimuovere eventuali detriti cellulari. Conservare l'HEVcc extracellulare raccolto a 4 °C per l'infezione nello stesso giorno; in caso contrario, conservare a -80 °C.
2. Per raccogliere l'HEVcc intracellulare (Figura 3), lavare le cellule con PBS 1x e sottoporle a tripsinizzazione aggiungendo 1,5 mL di tripsina-edetato (tripsina-EDTA) al 0,05%. Incubare a 37 °C finché le cellule non si staccano completamente. Aggiungere 10 mL di completeDMEM, raschiare la piastra per staccare le cellule e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 mL. Lavare le cellule due volte con PBS. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
   1. Eliminare il soprannatante e risospendere il pellet cellulare in 1,6 mL di DMEM completo per ogni elettroporazione. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da reazione da 2 mL.
      NOTA: Non utilizzare volumi superiori, poiché ciò ridurrebbe drasticamente il carico virale.
   2. Congelare (in azoto liquido) e scongelare le cellule. Ripetere questa sequenza per 3 volte.
      NOTA: Non unire più di un'elettroporazione (1,6 mL) per i cicli di congelamento-scongelamento, poiché l'efficienza della lisi ne risulterebbe compromessa. Non vortexare la sospensione cellulare tra un ciclo e l'altro. Assicurarsi di scongelare lentamente la sospensione cellulare (ad esempio, a temperatura ambiente o su ghiaccio) per massimizzare il carico virale.
   3. Sottoporre le cellule lisate a centrifugazione ad alta velocità per 10 minuti a 10.000 x g per separare i detriti cellulari. Trasferire il soprannatante in un nuovo tubo. Utilizzare il soprannatante per l'infezione; in caso contrario, conservarlo a -80 °C.
   4. Facoltativamente, concentrare l'HEVcc extracellulare e intracellulare utilizzando un concentratore per aumentare il carico virale.

Tabella 1: Tabella della composizione dei tamponi.

Soluzione pronta all'uso	Concentrazione	Volume
Collagene	40 mL	PBS
	40 µl	Acido acetico
	1 mL	Soluzione sterile di collagene R 0,4%
Cytomix	120 mM	KCl
	0,15 mM	CaCl2
	10 mM	K2HPO4 (pH 7,4)
	25 mM	HEPES
	2 mM	EGTA
DMEM completo	500 mL	DMEM
	5 mL	Pen/Strep
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutammina
	50 mL	Serum bovino fetale
MEM completo	500 mL	MEM
	5 mL	Piruvato di sodio
	5 mL	Gentamicina
	5 mL	MEM NEAA (100X)
	5 mL	L-Glutammina
	50 mL	ultra-low IgG

Risultati

Figura 1: Schema del set-up sperimentale per la preparazione delle cellule HepG2 per la produzione di virus dell'epatite E derivato da colture cellulari (HEVcc).

Figura 2: Schema del set-up sperimentale per l'elettroporazione delle cellule HepG2.

Figura 3: Schema del set-up sperimentale per la raccolta di HEVcc intracellulari ed extracellulari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0.45 µm mesh	Sarstedt	83.1826	Isolamento del virus extracellulare
MEM	gibco	31095-029	Cultura cellulare
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultura cellulare
Trypsin-EDTA (0.5 %)	gibco	15400054	Cultura cellulare
ultra-low IgG	gibco	1921005PJ	Cultura cellulare
Acido acetico	CarlRoth	6755.1	Soluzione lavorativa di collagene
ATP	Roche	11140965001	Trascrizione in vitro ed elettroporazione
BioRender	BioRender		Generazione di figure
Cloruro di calcio	Roth	5239.2	Cytomix
Soluzione di collagene R 0,4 % sterile	Serva	47256.01	Soluzione lavorativa di collagene
DMEM	gibco	41965-039	Cultura cellulare
EGTA	Roth	3054.3	Cytomix
GenePulser Xcell Electroporation System	BioRad	1652660	Elettroporazione
HEPES	Invitrogen	15630-03	Cytomix
Fosfato di di-potassio	Roth	P749.1	Cytomix
KCL	Roth	6781.3	Cytomix
Fosfato di potassio mono-basico	Roth	3904.2	Cytomix
L-Glutamin	gibco	25030081	Cultura cellulare
Glutatione ridotto	Sigma-Aldrich	G4251-5G	Cytomix
MEM	gibco	31095-029	Cultura cellulare
MEM NEAA (100×)	gibco	11140-035	Cultura cellulare
Cloruro di magnesio	Roth	2189.2	Cytomix
Microlitteratura UV-Vis spettrofotometro NanoDrop One	Thermo Fisher	ND-ONE-W	Concentrazione di DNA/RNA
PBS	gibco	70011051	Cultura cellulare
Pen/Strep	Thermo Fisher	15140122	Cultura cellulare