Purificazione del virus dal liquido allantoideo di uova di pollo embrionate

Abstract

Fonte: Yates, J. G. E., et al. Produzione di virus ricombinante della malattia di Newcastle ad alto titolo a partire dal liquido allantoinico. J. Vis. Exp. (2022)

Il video illustra la purificazione e la concentrazione di particelle virali da liquido allantocoico chiarificato ottenuto da uova di pollo embrionate infette da virus. Vengono mostrate una serie di fasi di filtrazione e separazione, tra cui la filtrazione a profondità, la filtrazione a flusso tangenziale e l'ultracentrifugazione su gradiente di densità, per isolare virus integri. La frazione ricca di virus viene quindi dializzata per rimuovere sali residui e componenti del gradiente mediante diffusione, seguita da concentrazione mediante soluzione ipertonica attraverso osmosi. Il risultato è una preparazione virale purificata ad alto titolo, adatta per l'uso sperimentale.

Protocollo

1. Amplificazione del virus della malattia di Newcastle (NDV) utilizzando uova di pollo embrionate libere da agenti patogeni specifici

1. Inoculazione di uova di pollo embrionate specifiche per i patogeni (SPF)
   NOTA: Di solito, otto dozzine di uova di pollo embrionate SPF vengono utilizzate per produrre un lotto di virus della malattia di Newcastle (NDV) di grado in vivo. Ordinare una o due dozzine di uova in più per compensare eventuali danni durante il trasporto e le variazioni di vitalità.
   1. Dopo aver ricevuto le uova di pollo embrionate SPF, incubarle in un incubatore per uova a 37 °C e umidità al 60% per 9 giorni. Assicurarsi che l'incubatore sia impostato per ruotare/oscillare automaticamente le uova ogni ora.
      NOTA: Le uova possono essere conservate a temperatura ambiente per un massimo di 24 ore o a 4 °C per un massimo di 72 ore; tuttavia, ciò potrebbe ridurre la vitalità dell'embrione.
   2. Dopo 8-11 giorni di incubazione (idealmente al nono giorno), effettuare la candeggiatura delle uova per determinare la vitalità dell'embrione. Cercare la vascolarizzazione a rete (Figura 1A) e il movimento dell'embrione come indicatori di embrioni vitali. Eliminare le uova che non presentano tali caratteristiche (Figura 1B).
   3. Sulle uova vitali, segnare con una matita una 'X' al confine tra la camera d'aria e l'embrione (Figura 1A). Assicurarsi che il sito di iniezione non perfori la vascolarizzazione. Riposizionare le uova segnate nell'incubatore mentre si prepara l'inoculo.
   4. Calcolare la quantità di virus necessaria per inoculare tutte le uova di pollo embrionate SPF. Assicurarsi che ogni uovo riceva 100 unità formanti placche (PFU) di virus in un volume di 100 µL; diluire il virus in soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) a una concentrazione di 1 × 10³ PFU/mL. Preparare un 20% aggiuntivo di inoculo per compensare eventuali imprecisioni nell'amministrazione del virus.
   5. Utilizzando un panno antistatico, pulire la sommità delle uova segnate con una soluzione di iodio al 10% diluita in etanolo al 70%. Attendere circa 1-2 minuti affinché la soluzione si asciughi.
   6. Perforare con attenzione il guscio utilizzando un paio di pinzette sterili e affilate. Disinfettare le pinzette con etanolo al 70% tra un uovo e l'altro.
   7. Utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 25 G, inoculare 100 µL dell'inoculo preparato al punto 1.1.4 nella cavità corioallantoidica (Figura 1C). Inserire l'ago con un angolo prossimo ai 90° rispetto all'uovo. Inserire l'ago appena al di sotto della membrana corioallantoidica.
   8. Dopo l'inoculazione, sigillare il foro con smalto per unghie e riposizionare le uova nell'incubatore. Assicurarsi che l'oscillazione sia attiva fino a 24 ore dopo l'inoculazione.
   9. Verificare la vitalità delle uova a 24 ore dall'inoculazione. Eliminare le uova morte che non presentano vascolarizzazione nella membrana corioallantoidica e movimento dell'embrione (Figura 1B).
      NOTA: Queste uova sono morte a causa del processo di inoculazione e non per effetto del virus NDV.
   10. Riposizionare le uova nell'incubatore, disattivando l'oscillazione per evitare la contaminazione del liquido allantoidico con proteine dell'uovo.
   11. Controllare le uova ogni 12-24 ore come descritto al punto 1.1.9 per identificare quelle morte. Spostare le uova che muoiono dopo 24 ore dall'inoculazione a 4 °C per minimizzare l'autolisi. Raccogliere il liquido allantoidico entro 2-12 ore dal raffreddamento.
   12. Incubare le uova per almeno 72 ore.
       NOTA: Se si sta propagando un ceppo mesogeno di NDV, il tempo di incubazione ottimale è di 60-72 ore, poiché tempi di incubazione più lunghi possono compromettere il processo di purificazione a causa della ridotta trasparenza del liquido allantoidico. Questo problema è meno rilevante quando si propagano ceppi lentogeni di NDV, che impiegano molto più tempo a uccidere l'embrione.
   13. Al termine del periodo di incubazione, spostare le uova rimanenti a 4 °C per 2-12 ore prima del prelievo del liquido allantoidico.
2. Prelievo del liquido allantoidico contenente NDV
   1. Portare le uova raffreddate nella cappa biologica. Pulire la sommità delle uova con etanolo al 70%.
   2. Utilizzare pinzette sterili e forbici chirurgiche per rompere la parte apicale dell'uovo dove si trova la camera d'aria.
   3. Rimuovere il guscio per esporre la membrana corioallantoidica (Figura 1D).
   4. Perforare con attenzione la membrana ed estrarla per esporre la cavità allantoidica (Figura 1E). Assicurarsi di non perforare accidentalmente il sacco vitellino, poiché ciò rovinerebbe l'uovo.
   5. Utilizzare pinzette a punta arrotondata per afferrare l'embrione e aprire il sacco embrionale.
      NOTA: Il liquido all'interno del sacco embrionale contiene anche NDV.
   6. Abbassare l'embrione con le pinzette e raccogliere il liquido allantoidico utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL.
   7. Conservare il liquido allantoidico sul ghiaccio in provette coniche da 15 mL fino alla chiarificazione.
      NOTA: Se il liquido allantoidico è giallo, il sacco vitellino è stato compromesso e il liquido allantoidico deve essere scartato.
   8. Centrifugare le provette coniche contenenti il liquido allantoidico a 1.500 × g per 10 minuti a 4 °C.
   9. Punto di pausa: Aliquotare il liquido allantoidico chiarificato in provette coniche da 50 mL e conservarle a -80 °C per la conservazione a lungo termine (ad esempio, settimane o mesi), aggiungendo al liquido saccarosio fino a una concentrazione finale del 5% per proteggere il virus dagli effetti dannosi dei cicli di congelamento-scongelamento. In alternativa, per la conservazione a breve termine (ad esempio, 1-3 giorni), aggiungere al liquido allantoidico saccarosio (5% finale) o tampone Mannitolo-Lisina (ML) 3× (15% Mannitolo, 3% Lisina) per ottenere una concentrazione finale di 1× (5% Mannitolo, 1% Lisina) prima della conservazione a 4 °C.

2. Purificazione del virus della malattia di Newcastle dal liquido allantoinico

1. Filtrazione a profondità del liquido allantoinico
   1. Conservare il liquido allantoinico chiarificato a -80 °C e scongelarlo a 4 °C la notte precedente la purificazione.
   2. In una cappa biologica, montare i tubi e la pompa peristaltica come mostrato in Figura 2.
   3. Se non già eseguita, combinare il liquido allantoinico con buffer ML 3× fino a una concentrazione finale di 1×.
   4. Prima di collegare il filtro a profondità, sterilizzare i tubi facendo passare 50 mL di idrossido di sodio (NaOH) 0,5 M attraverso il sistema in un contenitore di rifiuti.
   5. Risciacquare i tubi facendo passare 100 mL di acqua sterile di grado molecolare attraverso il sistema e nel contenitore di rifiuti.
      NOTA: Poiché l'NaOH inattiva il virus della malattia di Newcastle (NDV), è fondamentale che i tubi vengano adeguatamente lavati prima di introdurre il liquido allantoinico contenente il virus.
   6. Priming del sistema facendo passare 50 mL di PBS, fermando la pompa quando rimangono circa 5 mL di PBS nel tubo.
   7. Collegare un filtro a profondità con una capacità di ritenzione di 1-3 µm ai tubi e rimuovere il secondo tappo sul lato apicale del filtro per sfiatarlo. Iniziare a far passare ulteriori 50 mL di PBS attraverso il sistema.
   8. Quando il PBS inizia a fluire attraverso la valvola di sfiato in cima al filtro, chiudere la valvola e continuare a far passare il PBS attraverso i tubi.
      NOTA: Piccole bolle d'aria sono accettabili, ma la presenza di grandi quantità d'aria richiederà una nuova sfiatatura del filtro, come descritto nei passaggi 2.1.7 e 2.1.8.
   9. Fermare la pompa quando rimangono circa 5 mL di PBS nel tubo.
   10. Sostituire il contenitore di rifiuti con un nuovo contenitore sterile di raccolta e iniziare a far passare il liquido allantoinico attraverso il filtro a profondità.
       NOTA: La pressione non deve superare i 10 psi, poiché ciò provocherebbe lo sforamento del virus. La pressione può essere regolata riducendo o aumentando la portata della pompa. Se la pressione inizia a superare i 10 psi e la portata non può essere ulteriormente ridotta, si deve utilizzare un nuovo filtro a profondità. In questo caso, i passaggi 2.1.6-2.1.8 devono essere eseguiti prima di riprendere il flusso del liquido allantoinico.
   11. Una volta che tutto il liquido allantoinico ha attraversato il filtro, far passare 50 mL di buffer ML 1× attraverso i tubi per massimizzare il recupero del virus.
   12. Raccogliere il liquido finché i tubi non si svuotano completamente. Conservare il virus per tutta la notte o fino a 36 h a 4 °C.
       NOTA: Una volta filtrato il virus mediante filtrazione a profondità, proseguire il processo di purificazione entro 36 h dal completamento della filtrazione.
   13. Staccare il filtro a profondità e sanificare i tubi facendo passare 100 mL di NaOH 0,5 M e 400 parti per milione (ppm) di candeggina preriscaldata a 42 °C attraverso il sistema prima di conservarlo in NaOH 0,5 M.
2. Filtrazione tangenziale per la concentrazione del NDV
   1. Assemblare i componenti della cartuccia come mostrato in Figura 3A all'interno di una cappa biologica.
      NOTA: Il collettore e la piastra terminale devono essere lavati con detergente ed essiccati prima dell'uso. Le guarnizioni in silicone sono riutilizzabili e devono essere conservate in NaOH 0,5 M insieme alla cartuccia.
   2. Configurare il sistema di filtrazione tangenziale (TFF) (nota anche come filtrazione a flusso trasversale) in una conformazione "aperta" (Figura 3B).
      1. Se si utilizza per la prima volta una cartuccia, assemblarla nella conformazione di eluizione e risciacquarla con 100 mL di acqua sterile di grado molecolare (Figura 3C).
      2. Quando nel serbatoio rimangono solo circa 5 mL di acqua, mettere in pausa la pompa e modificare la configurazione del sistema TFF in una conformazione chiusa (Figura 3D).
      3. Aggiungere 100 mL di NaOH 0,5 M e candeggina 400 ppm preriscaldata a 42 °C nel serbatoio e far circolare la soluzione attraverso il sistema per 30-60 min.
      4. Mettere in pausa il flusso e riportare il sistema TFF alla configurazione di eluizione, riprendendo il flusso per eluire la soluzione di pulizia.
      5. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100 mL di acqua sterile di grado molecolare per risciacquare il sistema.
      6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa e posizionare il sistema TFF in conformazione aperta (Figura 3B). Proseguire con il passaggio 2.2.3.
   3. Sterilizzare la cartuccia e i tubi facendo passare 100 mL di NaOH 0,5 M attraverso il sistema utilizzando la pompa peristaltica. Assicurarsi che la pressione non superi i 30 psi per mantenere l'integrità della cartuccia.
   4. Mettere in pausa la pompa quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL di NaOH 0,5 M.
   5. Aggiungere 100 mL di acqua sterile di grado molecolare nel serbatoio e riprendere il passaggio del fluido attraverso la cartuccia. Mescolare il serbatoio per rimuovere tutto l'NaOH dalle pareti, per evitare l'inattivazione del virus. Ripetere il risciacquo del serbatoio.
   6. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL di acqua sterile di grado molecolare, mettere in pausa la pompa.
   7. Aggiungere 100 mL di PBS nel serbatoio, mescolando per assicurarsi che l'acqua sterile di grado molecolare venga rimossa dalle pareti. Riprendere il flusso del liquido attraverso la cartuccia.
   8. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa, aggiungere il liquido allantoinico filtrato a profondità nel serbatoio e riprendere il flusso della pompa.
   9. Monitorare il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi, per evitare lo sforamento del virus. Utilizzare una combinazione della velocità della pompa peristaltica e delle morsettiere a C per aumentare l'eluizione verso i rifiuti.
      NOTA: La combinazione della velocità della pompa peristaltica e delle morsettiere a C comporterà un aumento della pressione.
   10. Quando nel serbatoio rimangono 50-100 mL di liquido allantoinico, mettere in pausa la pompa per eseguire uno scambio di buffer aggiungendo 150-200 mL di buffer ML 1×.
   11. Riprendere il flusso della pompa, monitorando nuovamente il manometro 1 (Figura 3B) per assicurarsi che non superi i 10 psi.
   12. Quando nel serbatoio rimangono 5-10 mL, mettere in pausa la pompa.
   13. Utilizzando due morsettiere a C, chiudere le due linee di scarico come mostrato in Figura 3C.
   14. Scollegare la linea di ritenuto che alimenta il serbatoio e inserirla in un tubo conico da 50 mL (Figura 3C).
   15. Riprendere il flusso della pompa, mettendolo in pausa quando rimangono poche gocce di liquido nel serbatoio.
   16. Rimuovere le morsettiere a C dalle linee di scarico e ricollegare la linea di alimentazione del ritenuto al serbatoio (Figura 3B).
   17. Aggiungere 20-25 mL di buffer ML 1× e riprendere il flusso della pompa finché nel serbatoio non rimangono circa 5 mL.
   18. Ripetere i passaggi 2.2.13 a 2.2.16.
       NOTA: Una terza eluizione può essere eseguita ripetendo i passaggi 2.2.17 e da 2.2.13 a 2.2.16 per aumentare il rendimento virale. Tuttavia, la maggior parte del virus è presente nelle prime due eluizioni.
   19. Al termine delle eluizioni, porre il virus sul ghiaccio o a 4 °C.
   20. Per pulire i tubi, configurare il sistema in modo che formi un circuito chiuso (Figura 3D) con le linee di scarico che rientrano nel serbatoio, come mostrato in Figura 3D.
   21. Procedere alla pulizia del sistema aggiungendo 250 mL di NaOH 0,5 M e candeggina 400 ppm preriscaldata a 42 °C.
   22. Fare circolare la soluzione di pulizia attraverso il sistema per tutta la notte.
       NOTA: Durante la ricircolazione della soluzione di pulizia, se la pompa funziona a una velocità di 50 mL/min, si dovrebbe osservare una pressione di circa 5 psi. Se la pressione supera questo valore, la cartuccia è sporca, la soluzione di pulizia deve essere sostituita e il processo ripetuto.
   23. Eluire la soluzione di pulizia indirizzando entrambe le linee di scarico e la linea di ritenuto in un contenitore di rifiuti.
   24. Aggiungere 400-500 mL di acqua sterile nel serbatoio e farla passare attraverso il sistema nei contenitori di rifiuti.
   25. Quando nel serbatoio rimangono circa 5 mL, mettere in pausa la pompa e aggiungere 100-200 mL di NaOH 0,5 M nel serbatoio, mescolando la soluzione per lavare il contenitore.
   26. Una volta che il serbatoio è quasi vuoto, ripetere il passaggio 2.2.23 altre due volte.
   27. Smontare l'allestimento TFF, conservando la cartuccia TFF e le guarnizioni in un piccolo volume di NaOH 0,5 M all'interno di un sacchetto di plastica richiudibile a 4 °C.
       NOTA: I tubi possono essere conservati a temperatura ambiente immersi in NaOH 0,5 M.
3. Ultracentrifugazione su gradiente di densità di iodixanolo
   1. Accendere l'ultracentrifuga e impostarla per pre-raffreddare a 4 °C. Pre-raffreddare anche il rotore desiderato a 4 °C (vedere la Tabella dei Materiali).
      NOTA: I rotori devono essere conservati a 4 °C.
   2. Utilizzare la soluzione stock di iodixanolo al 60% (concentrazione al momento dell'acquisto) per preparare soluzioni al 40%, 20% e 10% diluendo con PBS e buffer ML 3× fino a una concentrazione finale di ML buffer 1×.
   3. In un tubo per ultracentrifuga da 13,2 mL, a fondo aperto e pareti sottili, sovrapporre rispettivamente 0,5 mL, 2,5 mL e 2,5 mL delle soluzioni di iodixanolo al 40%, 20% e 10% (Figura 4A).
      NOTA: Inclinare il tubo per ultracentrifuga lateralmente ed espellere lentamente la soluzione ridurrà significativamente il rischio di mescolamento tra i diversi strati del gradiente. La separazione tra ogni strato deve essere evidente, con un "alone" visibile tra ciascun livello del gradiente.
   4. Utilizzare un pennarello per segnare le interfacce tra i vari strati del gradiente.
   5. Deporre 6-6,5 mL del virus eluito dalla procedura TFF sopra il gradiente di densità. Aggiungere il virus con attenzione, come descritto nel passaggio 2.3.3, per evitare di disturbare il gradiente.
   6. Caricare i tubi per ultracentrifuga negli inserti per il rotore a cestello oscillante (vedere la Tabella dei Materiali) utilizzando una bilancia a fondo aperto per bilanciare gli inserti entro 0,01 g l'uno dall'altro. Utilizzare PBS o ulteriore eluente virale per compensare le differenze di peso.
   7. Una volta bilanciati i tubi, chiuderli con i tappi e caricarli nel rotore.
   8. Centrifugare per 1,5 h a 125.000 × g a 4 °C.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito durante la notte se si dispone di un'ultracentrifuga con funzione di avvio ritardato.
   9. Al termine dell'ultracentrifugazione, rimuovere i tubi con una pinza sterile. Cercare la banda bersaglio, una banda larga compresa tra i gradienti al 10% e al 20% (Figura 4B).
   10. Sospendere il tubo sopra un becher utilizzando un supporto a muro.
   11. Collegare un ago da 18 G × 1,5 pollici a una siringa da 5 mL e perforare lateralmente il tubo per ultracentrifuga.
       NOTA: Il tubo deve essere perforato leggermente al di sotto della banda bersaglio, con l'ago inclinato verso l'alto e il bisello rivolto verso l'alto in modo da entrare nella banda bersaglio.
   12. Estendere lentamente lo stantuffo per rimuovere la banda bersaglio.
       NOTA: Muovere l'ago all'interno della banda bersaglio per massimizzare il recupero virale. Prestare attenzione affinché altre bande o detriti non si mescolino alla banda bersaglio, e evitare di prelevare soluzione in eccesso, poiché ciò comporterebbe l'uso di più cassette per dialisi.
   13. Una volta estratta la banda bersaglio, rimuovere l'ago e lasciare che la soluzione rimanente defluisca nel becher di rifiuti. Dispensare la banda bersaglio in un tubo conico da 50 mL finché non sono state estratte tutte le bande da tutti gli altri tubi per ultracentrifuga.
   14. Ripetere i passaggi 2.3.10-2.3.13 finché tutte le bande bersaglio non sono state estratte da tutti i tubi per ultracentrifuga.
   15. Approccio alternativo all'estrazione delle bande bersaglio come descritto nei passaggi 2.3.10-2.3.13
       1. Rimuovere lentamente il liquido sovrastante la banda bersaglio utilizzando una pipetta. Una volta raggiunta la banda bersaglio, estrarla con la pipetta e conservare il virus in un tubo conico da 50 mL.
          NOTA: Questo metodo permette il riutilizzo dei tubi per ultracentrifuga.
4. Rimozione dell'iodixanolo dalla soluzione virale
   NOTA: La banda contenente NDV compare a una densità di iodixanolo compresa tra il 15% e il 16%. La concentrazione di iodixanolo nella soluzione può essere determinata misurando l'assorbanza a 340 nm in riferimento a una curva standard. Questo passaggio può essere omesso poiché non sono stati osservati effetti avversi o tossicità acuta quando soluzioni di iodixanolo a questa concentrazione sono state somministrate a topi C57BL/6.
   1. Pre-umidificare una cassetta per dialisi con taglio molecolare di 10 kDa da 0,5-3 mL immergendola in PBS per 1 min.
      NOTA: La membrana per dialisi dovrebbe passare da liscia ad avere un aspetto arricciato o irregolare. Se il volume di virus estratto supera i 10 mL, si devono utilizzare due cassette per dialisi da 0,5-3 mL o una cassetta da 5-12 mL.
   2. Se necessario, utilizzare una siringa da 5 o 10 mL e un ago da 18 G × 1,5 pollici senza punta per raccogliere il virus dal tubo conico da 50 mL.
   3. Utilizzare la siringa per entrare nella cassetta per dialisi, facendo attenzione a non forare la membrana, e iniettare il virus.
      NOTA: La cassetta per dialisi può essere ruotata per regolare la posizione della bolla d'aria all'interno. La bolla d'aria deve essere rimossa prima di estrarre l'ago dalla cassetta.
   4. Riempire un becher da 1 L con PBS sterile 1×, inserire una barretta magnetica e la cassetta per dialisi, quindi coprire. Incubare a 4 °C con leggera agitazione.
      NOTA: Utilizzare polistirene espanso e un elastico per fissare la cassetta in modo che galleggi nel PBS. La cassetta può gonfiarsi leggermente a causa del buffer ML.
   5. Dopo 1-2 h, sostituire con PBS fresco 1× e continuare l'incubazione a 4 °C per altre 8-10 h con leggera agitazione.
      NOTA: Questo passaggio può essere eseguito anche durante la notte.
   6. Sostituire con PBS fresco 1× un'ulteriore volta, incubando a temperatura ambiente per 1-2 h.
5. Concentrazione della soluzione virale
   1. Rimuovere la cassetta per dialisi dal buffer di dialisi (Figura 4C) e posizionarla in un piccolo sacchetto di plastica richiudibile. Aggiungere 15-25 mL di polietilenglicole al 40% con peso molecolare di 20.000 in modo che la cassetta per dialisi sia completamente immersa.
   2. Incubare a temperatura ambiente con agitazione oscillante. Controllare periodicamente il volume del virus nella cassetta utilizzando una siringa da 5 o 10 mL e un ago da 18 G × 1,5 pollici senza punta.
      NOTA: Il tempo necessario per concentrare il virus varia in base al volume iniziale e al volume finale desiderato. In genere, il volume finale desiderato è compreso tra 1 e 1,5 mL indipendentemente dal volume iniziale del liquido allantoinico. Quando si controlla il volume, prestare attenzione a non utilizzare lo stesso foro, poiché ciò comprometterebbe l'integrità del foro e potrebbe causare la mescolanza della soluzione di polietilenglicole con il virus.
   3. Prima di rimuovere il virus concentrato dalla cassetta per dialisi, risciacquare brevemente la cassetta in PBS 1× e riempire un ago da 18 G × 1,5 pollici senza punta con aria.
   4. Inserire la siringa piena d'aria nella cassetta per dialisi e premere lo stantuffo. Ruotare l'apparato in modo che il virus concentrato possa essere rimosso senza rimuovere l'aria introdotta.
   5. Dispensare il virus concentrato in un tubo conico da 50 mL, annotando il volume dispensato.
   6. Utilizzando la stessa siringa e ago, iniettare una quantità appropriata di saccarosio al 60% nella cassetta per dialisi in modo che, combinato con il virus precedentemente rimosso, si ottenga una concentrazione finale di saccarosio al 5%.
   7. Massaggiare delicatamente la membrana con le dita guantate per rimuovere il virus residuo che potrebbe essersi attaccato, facendo attenzione a non danneggiarla. Rimuovere parte dell'aria in eccesso nella cassetta per dialisi per facilitare il distacco.
   8. Combinare questo lavaggio con il virus già presente nel tubo conico da 50 mL.
      NOTA: Il virus è ora in saccarosio al 5% ed è pronto per essere dispensato in aliquote da 20 µL, 50 µL, 100 µL o 200 µL e conservato a -80 °C. In alternativa, per la conservazione a lungo termine, il NDV può essere liofilizzato e conservato a 4 °C come descritto nella sezione 2.6.

Risultati

Figura 1: Infezione e raccolta del virus della malattia di Newcastle (NDV) da uova di pollo embrionate libere da agenti patogeni specifici. (A) Dopo 9 giorni di incubazione, dovrebbe essere visibile una vascolarizzazione a rete (frecce), oltre al movimento dell'embrione. La 'X' indica l'interfaccia tra la membrana corioallantoinica e la camera d'aria, e il punto in cui deve essere praticato il foro per l'inoculazione dell'uovo. (B) Immagine che mostra un embrione morto. Si noti l'assenza della vascolarizzazione a rete. Non sarà inoltre osservabile alcun movimento dell'embrione. (C) Schema dei componenti di un'uovo di pollo embrionato che mostra le posizioni della camera d'aria, del sacco vitellino, del sacco amniotico, della membrana corioallantoinica e del liquido allantoinico. (D) Rimozione del guscio per esporre la membrana corioallantoinica. (E) Illustrazione dell'aspetto che il liquido allantoinico e l'embrione dovrebbero avere dopo l'apertura della membrana corioallantoinica. Abbreviazione: NDV = virus della malattia di Newcastle.

Figura 2: Schema che illustra il montaggio generale dell'apparato utilizzato per la filtrazione a profondità. Assicurarsi che il manometro sia installato a monte del filtro a profondità.

Figura 3: Configurazioni del sistema di filtrazione a flusso tangenziale. Le frecce indicano il verso del flusso del liquido. (A) Illustrazione del montaggio del cassetto TFF. (B) Schema del sistema TFF nella configurazione "aperta", utilizzata durante la purificazione e la concentrazione del liquido. (C) Schema del sistema TFF durante l’eluzione del liquido, come avviene nell’eluzione del virus e della soluzione di lavaggio. (D) Schema del sistema TFF nella configurazione "chiusa", utilizzata durante la pulizia del sistema TFF. Abbreviazione: TFF = Filtrazione a flusso tangenziale.

Figura 4: Ultracentrifugazione in gradiente di densità e dialisi del virus concentrato da TFF. (A) Schema che mostra la composizione del gradiente di densità di iodixanolo. (B) Modello di bande virali dopo ultracentrifugazione del virus prodotto utilizzando il tampone ML durante il processo di purificazione. La banda principale contenente il virus è indicata da un'ovale nera. (C) Dimensione tipica di una cassetta per dialisi caricata con 10 mL di virus preparato attraverso un gradiente di iodixanolo al termine della procedura di dialisi. Abbreviazione: TFF = Filtrazione tangenziale a flusso; ML = Mannitolo-Lisina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siringa da 1 mL con attacco conico	BD	309659
Siringa da 10 mL con attacco Luer-Lok	BD	302995
Soluzione di Povidone Iodio al 10%	LORIS	109-08
Tubi conici da 15 mL	Thermo-Fisher	14955240
Ago smussato da 18G x 1 1/2 pollice	BD	305180
Ago Precision Glide da 18G x 1 1/2 pollice	BD	305196
Ago da 25 G x 5/8 pollice	BD	305122
Siringa da 5 mL con attacco Luer-Lok	BD	309646
Acido acetico glaciale	Thermo-Fisher	A38-212
Agarosio	Froggabio	A87-500G
Alexa-Fluor 488 capra anti-topo	Invitrogen	A11001
Centrifuga Allegra X-14	Beckman Coulter	B08861
Persolfato di ammonio	BioRad	161-0700
Candeggina (5%)	Thermo-Fisher	36-102-0599
Pinzette con punta larga e non seghettata	Thermo-Fisher	09-753-50
Bromofenolo blu	Sigma-Aldrich	114405-25G
Portacassetta Centramate	PALL	CM018V
ChemiDoc XRS+	BioRad	1708265
Incubatore digitale per uova Sportsman 1502	Berry Hill	1502W
D-Mannitolo	Sigma-Aldrich	M4125-500G
Controllore luminoso per uova (Egg Candler)	Berry Hill	A46
Etilalcol (70%)	Thermo-Fisher	BP82031GAL
Raccordi a T femmina filettati, in nylon, 1/8 in NPT(F)	Cole-Parmer	06349-50
Kit per umidità	Berry Hill	3030
Iodixanolo	Sigma-Aldrich	D1556	Soluzione al 60% (p/v) di iodixanolo in acqua (sterile)
Cloridrato monoidrato di L-lisina	Sigma-Aldrich	62929-100G-F
Raccordi maschio e femmina Luer-Lok a 1/8 di filetto nazionale per tubi, NPT	Cole-Parmer	41507-44
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	RK-07522-20	Pompa peristaltica con display digitale
Testa della pompa Masterflex L/S Easy Load per tubi di precisione	Cole-Parmer	RK-07514-10
Tubazione in silicone Masterflex (platinico) L/S 16	Cole-Parmer	96420-16	Silicone curato al platino per uso biofarmaceutico
Cassetta per membrana Omega LV Centramate, 100K	PALL	OS100T02
Ultracentrifuga Optima XE-90	Beckman Coulter	A94471
Soluzione PBS 10X	Thermo-Fisher	BP399-20
Polietilene glicole con peso molecolare medio 20.000	Sigma-Aldrich	81300-1KG
Cassetta per dialisi Slide-a-lyzer (rinforzata), 10.000 MWCO, 0,5-3 mL	Thermo-Fisher	66380
Idrossido di sodio (in perle)	Thermo-Fisher	S318-10
Uova libere da patogeni specifici	CFIA	NA	Il fornitore può variare a seconda della località
Saccarosio	Thermo-Fisher	S5-3
Filtro a profondità Supracap 50	PALL	SC050V100P
Forbici chirurgiche	Thermo-Fisher	08-951-5
Rotor Sw41Ti	Beckman Coulter	331362	Utilizzato nel passaggio 2.3.1, 2.3.6, 2.3.7 del protocollo
Rotor SX4750	Beckman Coulter	369702
Adattatore SxX4750 per tubi con fondo conico	Beckman Coulter	359472
Tube ultrachiaro a parete sottile per centrifuga (9/16 in x 3 1/2 in)	Beckman Coulter	344059
Pinza a vite per tubi	PALL	88216
Manometri per uso generico	Cole-Parmer	68355-06