Riprogrammazione di cellule ematiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte mediante virus Sendai

Abstract

Fonte: Rim, Y. A., et al. Generazione di cellule staminali pluripotenti indotte da cellule del sangue utilizzando il virus di Sendai e la centrifugazione. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video illustra la generazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) da cellule mononucleate del sangue periferico umano mediante riprogrammazione mediata da virus di Sendai. I fattori di trascrizione virali attivano le reti di pluripotenza e sopprimono i geni di linea, consentendo a un sottoinsieme di cellule di acquisire proprietà adesive e formare colonie di iPSC. Il protocollo arricchisce e mantiene queste cellule riprogrammate attraverso il legame selettivo alla matrice e il rinnovo giornaliero del mezzo di coltura.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono il prelievo di campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida del comitato etico (IRB) dell'istituto.

1. Trasduzione mediante virus di Sendai

1. Trasduzione (Giorno 0)
   1. Raccogliere e trasferire le cellule del sangue in un tubo conico da 15 ml e contarle utilizzando un emocitometro.
   2. Preparare 3 x 10⁵ cellule per ogni trasduzione e centrifugare le cellule a 515 x g per 5 min a temperatura ambiente (RT).
   3. Eliminare il soprannatante per aspirazione e risospendere le cellule in 0,5 ml di mezzo per cellule ematiche.
   4. Trasferire le cellule in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti non rivestita.
   5. Scongelare la miscela del virus di Sendai in ghiaccio e aggiungerla alle cellule sospese. Aggiungere il virus di Sendai alle cellule seguendo le raccomandazioni del produttore.
   6. Sigillare la piastra con un film sigillante e centrifugarla a 1.150 x g per 30 min a 30 °C.
   7. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 °C in 5% CO₂ per tutta la notte (O/N).
2. Trasferimento delle cellule alla matrice con alimentatore (Giorno 1)
   1. Il giorno successivo, rivestire una piastra a 24 pozzetti con vitronectina. Diluire la soluzione di vitronectina in PBS per ottenere una concentrazione finale di 5 µg/ml. Aggiungere 1 ml di vitronectina in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti e incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Rimuovere la soluzione di rivestimento prima dell'uso. Le piastre rivestite possono essere conservate a temperatura ambiente per 3 giorni.
   2. Trasferire tutto il mezzo contenente le cellule e il virus nella pozzetta rivestita.
   3. Raccogliere le cellule rimanenti con un ulteriore 0,5 ml di mezzo fresco per cellule ematiche e aggiungerlo alla pozzetta contenente le cellule.
   4. Centrifugare la piastra a 1.150 x g per 10 min a 35 °C.
   5. Dopo la centrifugazione, rimuovere il soprannatante, aggiungere 1 ml di mezzo iPSC e mantenere le cellule a 37 °C in 5% CO₂ per tutta la notte (O/N).
3. Secondo trasferimento cellulare (Giorno 2)
   1. Rivestire le pozzette di una nuova piastra a 24 pozzetti con vitronectina 5 µg/ml, come descritto al punto 1.2.1. Utilizzare una pozzetta della piastra per ogni trasduzione.
   2. Trasferire la sospensione cellulare dalla prima piastra alla nuova piastra rivestita con vitronectina.
      NOTA: Se non necessarie, le cellule in sospensione possono essere eliminate. La procedura menzionata al punto 2.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le cellule in sospensione. Se i passaggi vengono ripetuti, raccogliere le cellule.
   3. Nel frattempo, aggiungere 1 ml di mezzo iPSC (cellule staminali pluripotenti indotte) nella pozzetta della prima piastra, per il mantenimento, e incubare a 37 °C in 5% CO₂ per tutta la notte (O/N).
   4. Mantenere le cellule aderenti a 37 °C e 5% CO₂ e effettuare un cambio giornaliero del mezzo con mezzo iPSC fresco. Le colonie appariranno tra i giorni 14 e 21 dopo la trasduzione.
   5. Centrifugare la piastra appena rivestita contenente le cellule in sospensione a 1.150 x g e 35 °C per 10 min.
   6. Dopo la centrifugazione, incubare le cellule a 37 °C in 5% CO₂ per tutta la notte (O/N).
   7. Il giorno successivo, rimuovere il soprannatante e sostituirlo con mezzo iPSC fresco.
      NOTA: La procedura menzionata al punto 1.3 può essere ripetuta 2-3 volte con le cellule in sospensione. Se i passaggi verranno ripetuti, raccogliere le cellule nel soprannatante e ripetere il punto 1.3.
   8. Mantenere le cellule aderenti con cambi giornalieri del mezzo fino al raggiungimento di una confluenza dell'80%.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura in plastica
Provetta conica da 50 ml	SPL	50050
Provetta conica da 15 ml	SPL	50015
Pipetta monouso da 10 ml	Falcon	7551
Pipetta monouso da 5 ml	Falcon	7543
Piastra a 12 pozzetti	TPP	92012
Piastra a 24 pozzetti	TPP	92024
Materiali per la generazione e la coltura di iPSC
CytoTune-iPSC Sendai Reprogramming Kit	Life Technologies	A16518
TeSR-E8 Media	STEMCELL Technologies	5940	mezzo per iPSC
Vitronectina	Life Technologies	A14700
TrypLE express (TrypLE)	Life Technologies	12604-039
ReleSR	STEMCELL Technologies	12604-039	soluzione per il distacco delle colonie