Analisi dell'internalizzazione del virus dell'influenza tramite saggio di blocco con streptavidina

Abstract

Fonte: Pohl, M. O. & Stertz, S. Misurazione dell'Attacco e dell'Internalizzazione del Virus dell'Influenza A in Cellule A549 mediante Citometria a Flusso. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video illustra l'utilizzo di un saggio di blocco con streptavidina per distinguere il virus dell'influenza legato alla superficie da quello internalizzato nelle cellule epiteliali polmonari umane. Il confronto dei segnali di fluorescenza mostra che un'intensità maggiore dopo l'incubazione indica un'internalizzazione virale avvenuta con successo.

Protocollo

1. Saggio di adesione/internalizzazione

NOTA: Assicurarsi di preparare tutti i reagenti prima di iniziare il saggio. Per i tre gruppi di controllo presentati nella sezione dei risultati (cellule mock-infettate, cellule pretrattate con neuraminidasi e cellule trattate con azide di sodio), sono necessarie piccole modifiche al protocollo.

1. Preparare 16 provette deepwell, ciascuna contenente 200.000 cellule A549. Accanto al gruppo sperimentale composto da 4 provette, sono presenti 3 condizioni di controllo, ciascuna richiedente 4 provette: cellule mock-infettate, cellule pretrattate con neuraminidasi (NA) e cellule trattate con azide di sodio. Ogni gruppo è composto da 4 provette etichettate come ‘0 min’, ‘0 min + streptavidina (STV)’, ‘30 min’, ‘30 min + STV’.
2. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS).
3. Centrifugare le provette a 4 °C a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente 0,3% di albumina sierica bovina (BSA), 20 mM 4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES) e 1% di penicillina-streptomicina (mezzo di incubazione). Incubare per 30 min a 37 °C.
   NOTA: Per il controllo con neuraminidasi: utilizzare neuraminidasi batterica (ad es. sialidasi da Vibrio cholera) a una concentrazione di 200 mU/ml diluita nel mezzo di incubazione per risospendere le cellule.
4. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di PBS. Ripetere questo passaggio un’altra volta, quindi raffreddare le provette sul ghiaccio per 10 min.
5. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 100 µl di virus biotinilato (utilizzare la concentrazione di virus determinata nella sezione 2 diluita in infection-PBS). Incubare per 1 ora sul ghiaccio.
6. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di PBS. Ripetere questo passaggio un’altra volta.
   NOTA: Per il controllo mock-infettato: utilizzare infection-PBS senza virus. Per il controllo con azide di sodio: utilizzare virus diluito in infection-PBS supplementato con 0,1% di azide di sodio.
7. Elaborazione dei campioni dopo l'infezione sul ghiaccio:
   1. Per i campioni ‘0 min’, seguire il passaggio 2.5 e conservare i campioni a 4 °C fino a quando gli altri campioni non vengono fissati.
   2. Per i campioni ‘0 min + STV’, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere i pellet in 50 µl di STV (utilizzare la concentrazione determinata nella sezione 3) diluita in PBS contenente 2% di BSA e 0,1% di azide di sodio (per prevenire l’internalizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare per 30 min sul ghiaccio.
   3. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di PBS. Ripetere questo passaggio un’altra volta.
   4. Per la fissazione, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 100 µl di paraformaldeide al 3,7% (PFA). Incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT). Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritto nel punto 1.6) e conservare i campioni a 4 °C.
   5. Per i campioni ’30 min’, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di PBS contenente 2% di BSA. Incubare per 30 min a 37 °C. Seguire i passaggi 1.7.3-1.7.4 e conservare i campioni a 4 °C.
      NOTA: Per il controllo con azide di sodio: utilizzare PBS supplementato con 2% di BSA e 0,1% di azide di sodio per l’incubazione di 30 min a 37 °C.
   6. Per i campioni ’30 min + STV’, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 200 µl di PBS contenente 2% di BSA. Incubare per 30 min a 37 °C. Quindi, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere i pellet in 50 µl di STV (utilizzare la concentrazione determinata nella sezione 3) diluita in PBS contenente 2% di BSA e 0,1% di azide di sodio (per prevenire l’internalizzazione durante la manipolazione del campione). Incubare per 30 min sul ghiaccio. Seguire i passaggi 1.7.3-1.7.4 e conservare i campioni a 4 °C.
      NOTA: Per il controllo con azide di sodio: utilizzare PBS supplementato con 2% di BSA e 0,1% di azide di sodio per l’incubazione di 30 min a 37 °C.
8. Per la permeabilizzazione, centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 100 µl di PBS contenente 0,5% di Triton X-100. Incubare per 6 min a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritto nel punto 1.6).
9. Centrifugare le provette a 4 °C per 3 min a 450 x g. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet in 50 µl di BSA al 2% diluita in PBS contenente STV-Cy3. (Si noti che la concentrazione appropriata di STV-Cy3 deve essere determinata prima di iniziare l’esperimento. Iniziare con una diluizione 1:200 e testare diluizioni doppie fino a 1:2.400. Nella nostra esperienza, una diluizione 1:1.000 si è rivelata ottimale.)
10. Incubare per 1 ora al buio a temperatura ambiente. Quindi, ripetere il passaggio di lavaggio descritto nel punto 1.6, ma risospendere il pellet in 200 µl di BSA al 2% diluita in PBS.
11. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso. Determinare la percentuale di cellule positive per Cy3 in ciascun campione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Life Technologies	41966-052
FBS	Life Technologies	10270-106
Penicillina-Streptomicina	Life Technologies	15140-163
PBS	Life Technologies	14190-169
BSA	VWR Calbiochem	126579
HEPES	Life Technologies	15630-100
D-Saccarosio	Fluka	84100
Test proteico Bio Rad	Bio Rad	500-0006
Tubi deepwell (microtubi da 1,2 ml)	Milian	82 00 001
PFA	Lucerna chem Electron microscopy sciences	15710
Tubi per ultracentrifuga	Hemotec HmbH	253070
Triton X-100	Fluka	93420
STV-Cy3	Life Technologies	43-4315
STV	Life Technologies	43-4302
Azoturo di sodio	Fluka	71290
Neuraminidasi/sialidasi batterica	Sigma-Aldrich	N6514-1UN