Valutazione dell'inibizione della crescita batterica mediata da fagi mediante misurazioni della densità ottica

Abstract

Fonte: Niu, Y. D., et al. Efficacia dei batteriofagi per il controllo biologico dei patogeni alimentari valutata mediante sistemi ad alta capacità. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video illustra un saggio basato su micropiastre per valutare l'attività litica di miscele di fagi contro colture batteriche di E.coli. Mette in evidenza come le variazioni della densità ottica rivelino la potenza dei fagi e la concentrazione necessaria per ottenere l'inibizione completa dei batteri

Protocollo

1. Preparazione del buffer e dei reagenti

1. Preparare 500 mL di brodo tripticoso (TSB) (15 g di polvere di TSB e 500 mL di acqua ultrapura) e sterilizzare in autoclave.
   NOTA: Questo può essere conservato a temperatura ambiente fino a 3 mesi o a 4 °C fino a 6 mesi.
2. Preparare 500 mL di agar tripticoso (TSA) (20 g di polvere di TSA e 500 mL di acqua ultrapura) e sterilizzare in autoclave.
   NOTA: Questo può essere conservato a 4 °C fino a 3 mesi.
3. Preparare 500 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS; 4 g di NaCl, 0,1 g di KCl, 0,77 g di Na₂HPO₄ e 0,12 g di KH₂PO₄, 500 mL di acqua ultrapura), misurare e regolare il pH a 7,2 ± 0,2 a 25 °C e sterilizzare in autoclave.
   NOTA: Questo può essere conservato a 4 °C fino a 6 mesi.
4. Preparare 200 mL di MgSO₄ 1 M (49,294 g e 200 mL di acqua ultrapura) e sterilizzare mediante filtro in polietersolfone da 0,22 µm.
5. Preparare 500 mL di TSB con MgSO₄ 10 mM (mTSB; 15 g di polvere di TSB, 500 mL di acqua ultrapura e 5 mL di MgSO₄ 1 M) e sterilizzare in autoclave; lasciare raffreddare il terreno sterilizzato fino a temperatura ambiente. Applicare la tecnica asettica. Utilizzando una pipetta serologica, trasferire con attenzione 5,0 mL di MgSO₄ 1 M; agitare delicatamente per omogeneizzare.

2. Preparazione della coltura batterica

1. Per preparare la coltura batterica da laboratorio (BRLC), rimuovere le provette con stock glicerolato(i) dall'inventario del congelatore e trasferirle in laboratorio.
2. Utilizzando un’ansa di inoculazione monouso o equivalente, immergerla nella provetta, prelevare una piccola quantità di inocolo (sospensione congelata) e seminare per striscia su una piastra TSA o equivalente all'interno di un armadio di sicurezza biologica di livello II. Incubare la piastra a 37 ± 2 °C per 15−18 h.
3. Imballare le piastre BRLC preparate e conservarle a 4 °C.
   NOTA: Periodo di scadenza generale per la BRLC: 14 giorni a 4 °C dopo la preparazione.
4. Inoculare una singola colonia di ciascun ceppo di E. coli O157 proveniente dalle piastre BRLC da testare in 10 mL di TSB e incubare in condizioni statiche a 37 °C per 18 h fino a raggiungere una concentrazione di 9 log10 UFC/mL.
5. Preparare una diluizione seriale delle colture notturne (la mattina seguente), utilizzando per ciascun ceppo di E. coli O157 mTSB contenente 10 mM di MgSO₄, per ottenere un valore di 4-5 log10 UFC/mL (o un altro livello di inocolo desiderato).
6. Mescolare volumi uguali della coltura notturna di ciascun ceppo per ottenere un totale di 4-5 log10 UFC/mL (o il valore desiderato) al fine di preparare la miscela batterica.
7. Collocare immediatamente la coltura batterica diluita a 4 °C in attesa di utilizzo.
8. Diluire la coltura inocolo di 10 o 100 volte e piastrare aliquote di 0,1 mL di queste diluizioni su piastre TSA per ottenere colonie isolate.

3. Preparazione delle soluzioni di lavoro dei fagi

1. Propagare stock di lavoro ad alta titolazione per ciascun batteriofago da sottoporre a screening (≥108 PFU/mL) seguendo i metodi standard4.
   NOTA: Il periodo di scadenza generale per le scorte di fagi è di 3 mesi in una bottiglia di plastica a 4 °C dopo la generazione.
2. Per ottenere il titolo desiderato, ad esempio ~10⁸ PFU/mL per la cinetica della lisi, diluire le preparazioni di fago singole in mTSB contenente 10 mM di MgSO₄₄Preparare i cocktail di fagi mescolando volumi uguali di ciascun stock di lavoro con lo stesso titolo in tutte le possibili combinazioni.

4. Preparazione di in vitro cinetica della lisi per fagi singoli e cocktail di fagi

1. Preparare diluizioni seriali decrescenti di ciascun fago nelle colonne da 1 a 8 in micropiastre sterili a 96 pozzetti per impostare il saggio in microtitolazione.
   NOTA: Quattro fagi contro un ceppo batterico possono essere testati in duplicato, in colonne adiacenti, su ogni piastra. Le rimanenti quattro colonne sono destinate ai controlli, senza fago, nonché al bianco di mTSB (Figura 1).
2. Aggiungere 180 µL di mTSB nei pozzetti delle colonne da 1 a 12 della micropiastra a 96 pozzetti.
3. Aggiungere 20 µL di fagi singoli diluiti o cocktail di fagi (~108 PFU/mL) nei pozzetti da 1 a 8 della riga superiore della micropiastra (riga A).
4. Per il controllo senza fago e il bianco, aggiungere 20 µL di mTSB nel pozzetto superiore delle colonne 9, 10 e 11.
5. Con una pipetta a 12 canali, effettuare la diluizione della piastra. Trasferire 20 µL da riga a riga. Mescolare accuratamente il contenuto mediante aspirazione ed espulsione ripetute e delicate (almeno cinque volte), cambiando le punte tra una diluizione e l'altra. Rimuovere 20 µL dall'ultima riga (riga H).
   NOTA: Si raccomanda l'uso di punte con filtro per prevenire contaminazioni incrociate.
6. Preparare un serbatoio per ciascun ceppo. Utilizzare una pipetta da 1 mL per trasferire 2-3 mL del coltura diluita nel serbatoio. Per le colonne da 1 a 10, usare una pipetta multicanale per aggiungere 20 µL della coltura batterica diluita in ciascun pozzetto. Cambiare le punte dopo ogni aggiunta.
7. Coprire e incubare la micropiastra nelle condizioni desiderate (ad esempio, 37 °C per 10 h o 22 °C per 22 h).
8. Ad intervalli di 2 h o ad altri intervalli desiderati, rimuovere le micropiastre dall'incubatore.

Risultati

Figura 1: Disposizione suggerita per il saggio in micropiastre a 96 pozzetti. Diluizioni seriali di ciascun fago effettuate con un fattore 10 sono preparate nelle colonne da 1 a 8 di micropiastre sterili a 96 pozzetti. Quattro fagi contro un ceppo batterico possono essere testati in duplicato, in colonne adiacenti, su ciascuna piastra. Le colonne rimanenti sono destinate ai controlli.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiali, reagenti e attrezzature essenziali
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma	1374361
Pipetta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+	METTLER TOLEDO	17014382
Pipetta Pipet-Lite LTS L-300XLS+	METTLER TOLEDO	17014405
Pipetta multi-canale Pipet-Lite L12-20XLS+	METTLER TOLEDO	17013808
Pipetta Pipet-Lite universale SL-20XLS+	METTLER TOLEDO	17014412
Punte per pipetta RT LTS 1000µL FL 768A/8, a bassa ritenzione	METTLER TOLEDO	30389213
Punte per pipetta SR LTS 20µL F 960A/5	METTLER TOLEDO	17005860
Reservoir	METTLER TOLEDO	89094-662
Piastre microtitolazione sterili, trasparenti, a 96 pozzetti con fondo piatto in polistirene, con coperchi	Fisher	168055
Agar triptico-soia (TSA)	Sigma	105458-0500
Brodo triptico-soia (TSB)	Sigma	105459-0500
Stender a forma di T	VWR	76299-566
Strumenti
Incubatori microbiologici compatti	Fisher	50125590H
Barre di agitazione a forma poligonale	Fisher	14-512-125	lunghezza: 20 mm
Lettore ibrido multicanale Synergy Neo2	Fisher	BTNEO2M
Software
SAS	SAS Institute	9.4