Marcatura dei genomi di HSV-1 in replicazione con un analogo nucleosidico

Abstract

Fonte: Dembowski, J. A., Deluca, N. A. Purificazione del DNA virale per l'identificazione delle proteine virali e cellulari associate. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra l'infezione di cellule mammifere in fase stazionaria con HSV-1 (Herpes Simplex Virus-1), seguita dalla replicazione del genoma virale mediante la macchinaria di replicazione virale e dell'ospite. Un analogo nucleosidico sintetico viene incorporato nel DNA virale appena sintetizzato per etichettare i genomi in replicazione, che successivamente vengono isolati per l'analisi proteomica delle proteine virali e dell'ospite associate.

Protocollo

1. Coltura cellulare, infezione virale e marcatura con EdC (5-Etinil-2′-deossicitidina) (Figura 1)

Il seguente protocollo prevede il lavoro con virus. Si prega di fare riferimento ai protocolli di biosicurezza della propria istituzione per quanto riguarda la manipolazione sicura di virus e altri agenti biologici. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato per la Revisione Istituzionale dell'Università di Pittsburgh.

1. Triturare con tripsina una fiasca da coltura tessutale da 150 cm² confluente di cellule MRC-5 e trasferire le cellule in una piastra da coltura tessutale da 600 cm² contenente 100 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) più 10% di FBS. Incubare a 37 °C in presenza di 5% di CO₂ per 3-4 giorni fino al raggiungimento della confluenza e della fase stazionaria. Una piastra da 600 cm² confluente contiene circa 7 x 10⁷ cellule. Preparare una piastra per ogni condizione sperimentale e una piastra per ciascun controllo negativo corrispondente.² flacone per coltura cellulare di cellule MRC-5 (ceppo cellulare 5 del Medical Research Council) e trasferire le cellule in una piastra per coltura cellulare di 600 cm² contenente 100 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) più il 10% di FBS. Incubare a 37 °C in presenza di CO₂ al 5%₂ per 3 - 4 giorni fino a raggiungere la confluenza e la fase stazionaria. Una piastra da 600 cm² confluenziale contiene ~7 x 10⁷ Cellule. Preparare 1 piastra per ogni condizione e 1 piastra per ciascun controllo negativo corrispondente.
   NOTA: Le cellule devono raggiungere la fase stazionaria per inibire la replicazione del DNA cellulare, al fine di garantire che solo il vDNA (DNA virale) venga etichettato e purificato nei passaggi successivi.
   NOTA: Ogni campione richiede un controllo negativo non marcato complementare, preparato utilizzando le stesse condizioni di infezione e lo stesso punto temporale, senza l'aggiunta di EdC.
   NOTA: Una versione ridotta di questo esperimento deve essere eseguita in parallelo per verificare l'etichettatura del DNA cellulare mediante imaging, utilizzando condizioni comparabili di crescita cellulare, infezione, etichettatura con EdC e punti temporali (vedere Passaggio 2).
2. Diluire 7 x 10⁸ PFU (unità formanti placche) HSV-1 in 7 mL di soluzione salina tamponata al Tris (TBS) fredda. Rimuovere il mezzo di crescita e conservare a 37 °CPer infettare, aggiungere il virus diluito in un volume di 7 mL alle cellule MRC-5 e agitare dolcemente per 1 h a temperatura ambiente. Dopo l'adsorbimento, rimuovere l'inoculo, lavare con 50 mL di TBS a temperatura ambiente e sostituire con il mezzo di crescita originale. Incubare a 37 °C in presenza di CO₂ al 5%₂Questo passaggio deve essere eseguito per ciascuna condizione sperimentale e per ciascun controllo negativo.
   NOTA: Un'etichettatura aumentata con EdC può essere ottenuta utilizzando mutanti dell'HSV-1 difettivi per l'espressione della dUTPasi virale (gene UL50) e/o della uracile glicosilasi (gene UL2). La dUTPasi dell'HSV-1 presenta una bassa specificità del substrato e può ridurre l'attivazione di diversi analoghi nucleosidici.
3. Etichettare i genomi virali con EdC. Seguire le istruzioni per etichettare i genomi in entrata (1.3.1.), i genomi in replicazione (1.3.2.) o le forcelle di replicazione virali (1.3.3.).
   NOTA: Eseguire solo il passaggio 1.3.1, 1.3.2 o 1.3.3 a seconda che, rispettivamente, nei passaggi successivi si intenda analizzare i genomi entranti, i genomi replicati o le forcelle di replicazione.
   NOTA: EdU o f-ara EdU possono essere utilizzati in sostituzione di EdC. La tossicità degli analoghi dei nucleosidi deve essere monitorata e ridotta al minimo.
   1. Utilizzare stock preetichettati per eseguire l'infezione al Punto 1.2 e procedere al Punto 2 o 3 entro 4 h post-infezione (hpi) per analizzare il vDNA non replicato (Figura 1A).
      NOTA: Preparare stock di virus premarcati utilizzando il protocollo precedentemente descritto25. Gli stock di virus devono essere purificati attraverso una colonna G-25 per rimuovere qualsiasi residuo di EdC.
   2. Etichettare il vDNA replicante aggiungendo 5 - 25 µM EdC al mezzo di coltura cellulare delle cellule infette per 2 - 4 h (Figura 1B). Prima dell'aggiunta, diluire l'EdC in 1 mL di mezzo di crescita.
   3. Per etichettare i forconi di replicazione virale, dopo l'inizio della replicazione del vDNA (≥4 hpi), etichettare in impulsi il vDNA in replicazione con 5 - 25 µM EdC per 5-20 min. Per effettuare il chase, risciacquare 3 volte con mezzo di chase contenente 25 - 100 µM 2'-deossicitidina (deoxyC), quindi incubare in presenza di mezzo di chasing per ulteriori 20-40 min (Figura 1C).
      NOTA: Il mezzo per il pulse e il chase deve essere equilibrato a 37 °C e 5% CO₂₂ prima dell'uso
      NOTA: Nei esperimenti di pulse chase, è importante considerare il tempo necessario affinché i nucleosidi entrino nella cellula e vengano fosforilati prima di essere incorporati nel DNA in replicazione. Questo tempo deve essere determinato empiricamente.
      NOTA: Per determinare la risoluzione degli esperimenti di chase in impulsi, calcolare la velocità di replicazione virale nelle condizioni sperimentali utilizzate. Questo parametro può essere determinato mediante PCR quantitativa dei genomi virali durante un corso di crescita in un unico passaggio.

Risultati

Figura 1: Approcci per etichettare il DNA di HSV-1. (A) Per saggare lo stato del virus entrante, cellule MRC-5 quiescenti in fase G0 vengono infettate con HSV-1 pre-etichettato e i genomi vengono analizzati entro meno di 4 ore post-infezione (hpi) per studiare il DNA virale non replicato. (B) Per saggare lo stato del virus replicato, le cellule MRC-5 vengono infettate con HSV-1 non etichettato e l'EdC (stelle arancioni) viene aggiunta al mezzo di coltura delle cellule infette e incubata per 2-4 ore dopo l'inizio della replicazione del DNA virale (≥4 hpi). (C) Per saggare i forcelle di replicazione virale, le cellule infette vengono sottoposte a un'etichettatura pulsata con EdC per 5-20 minuti. Le forcelle di replicazione possono quindi essere tracciate con deoxyC. Il DNA etichettato con EdC è arancione. Questa figura è stata modificata da Dembowski e DeLuca

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule MRC-5	ATCC	CCL-171
Serum fetale bovino (FBS)	Gibco	26140-179
Mezzo di coltura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Gibco	12800-082	Sostituito con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 12 mM (per la crescita in fiasche) o 30 mM (per la crescita in piastre) bicarbonato di sodio
Piastra da coltura tissutale da 600 cm²	Thermo Fisher Scientific	166508
Soluzione salina tampone al Tris (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricina
Stocchi di HSV-1			Gli stocchi con titoli superiori a 1x10⁹ PFU/mL danno i migliori risultati
5´-Etinil-2´-deossicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Sciogliere in DMSO per preparare uno stock da 40 mM, aliquotare e conservare a -20 °C
Incubatore per colture cellulari
Cappa a sicurezza biologica
Block termostatici			65 °C e 95 °C