Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Produzione additiva di modelli Flexipeg
- Stampa di pioli (sono necessari 24 pioli per ogni coperchio del piolo) e coperchi dei pioli in resina stabile alle alte temperature utilizzando la stereolitografia (altezza dello strato di 100 μm).
NOTA: Per i pioli viene utilizzata una resina stabile alle alte temperature e i coperchi dei pioli possono essere sterilizzati in autoclave prima della sperimentazione. - Stampa in 3D sia i componenti dello stampo che parti del rack per provette utilizzando la modellazione a deposizione fusa (FDM) con riempimento del 60%.
NOTA: Qualsiasi resina durevole è adatta per l'FDM, poiché gli stampi e i rack per provette possono essere sterilizzati con etanolo e non richiedono stabilità alle alte temperature. - Assicurarsi che i componenti del modello siano stati stampati correttamente e rimuovere eventuali residui in eccesso dal processo di stampa utilizzando etanolo al 70%.
- Assemblare lo stampo per tappetino in silicone come mostrato nella Figura 1, tenendo i lati in posizione con del nastro adesivo se necessario.
2. Preparazione del modello Flexipeg
- Preparazione tappetino in silicone
- Pesare 18 g di base siliconica (10:1 base/catalizzatore polidimetilsilossano (PDMS), polimerizzazione per condensazione) in un becher e mescolare delicatamente 2 g di catalizzatore fino a quando non sarà ben amalgamato.
NOTA: Evitare di agitare eccessivamente la miscela siliconica per evitare la formazione di bolle all'interno dello stampo. - Versare la miscela di silicone combinata nello stampo stampato FDM, rimuovendo la miscela di silicone in eccesso dai lati e dalla parte superiore dello stampo. Lasciare indurire per una notte (minimo 18 ore) a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il tappetino dallo stampo e tagliare il silicone in eccesso dai lati. Assicurarsi che il tappetino si adatti al coperchio del piolo, come mostrato nella Figura 1.
- Rivestimento del piolo
- Inserire i pioli in un tappetino in silicone (24 pioli per tappetino) e fissare il tappetino al coperchio del piolo o a un vassoio di plastica di dimensioni simili al tappetino utilizzando del nastro adesivo.
- Pesare 27 g di base in silicone in una vaschetta di plastica poco profonda (approssimativamente delle stesse dimensioni di una piastra a 96 pozzetti) e mescolare accuratamente 3 g di catalizzatore fino a quando non sarà ben amalgamato.
- Capovolgere i coperchi dei pioli in modo che siano rivolti verso il basso e immergere immediatamente i pioli nella miscela di silicone. Capovolgere il coperchio del piolo e lasciare che il silicone in eccesso goccioli lungo i pioli e che i pioli si induriscano per una notte a temperatura ambiente.
NOTA: Il silicone a polimerizzazione rapida (6-8 ore di polimerizzazione completa; 40-60 minuti di lavoro) continuerà a gocciolare/fluire prima dell'indurimento; pertanto, non è imperativo rivestire l'intero piolo in PDMS durante l'immersione, poiché qualsiasi eccesso ricoprirà il resto del piolo durante l'indurimento. - Una volta indurito, ripetere i passaggi da 2.2.2 a 2.2.3. fino a quando i pioli non sono stati rivestiti tre volte in PDMS. Assicurarsi che il primo strato di rivestimento sia completamente indurito prima di procedere alla seconda fase di rivestimento.
NOTA: I rivestimenti finali dei pioli devono avere uno spessore di <2 mm senza imperfezioni visibili. Se il silicone rimane appiccicoso dopo l'incubazione notturna a RT, lasciarlo indurire per 24 ore e scartare i rivestimenti se i pioli sono ancora appiccicosi al tatto. - Utilizzando un bisturi sterile, tagliare intorno alla base dei pioli rivestiti di silicone (il più vicino possibile al fondo) per rimuovere i pioli dalla configurazione del rivestimento.
NOTA: Questo processo deve essere ripetuto fino a quando non viene preparato il numero desiderato di pioli e tappetini in silicone. L'eccesso di PDMS utilizzato nel processo di rivestimento dei pioli può essere utilizzato per fondere nuovi tappetini in silicone prima dell'indurimento.
- Impostazione del modello
- Inserire i pioli rivestiti nel tappetino in silicone e fissare il tappetino nel coperchio del piolo, come mostrato nella Figura 1.
- Copri la parte inferiore del coperchio del piolo/tappetino in silicone (attaccato alla base del piolo) con nastro autoclavabile per mantenere i pioli in posizione. Posizionare la configurazione del coperchio del piolo in un sacchetto sigillato autoclavabile e sterilizzare in autoclave prima dell'uso.
NOTA: I pioli nel coperchio del piolo si inseriscono in una piastra a 96 pozzetti con un unico orientamento. Dopo aver fissato con nastro adesivo la configurazione dei pioli, controllare l'allineamento dei pioli in una piastra di ricambio a 96 pozzetti ed etichettare il nastro per autoclave di conseguenza con l'orientamento corretto del coperchio.
3. Inoculazione dei modelli
- Preparazione della coltura batterica
- Preparare colture notturne di isolati batterici in prova sospendendo un anello di colonie batteriche coltivate su terreni solidi in 10 ml di brodo Luria-Bertani (LB). Incubare per una notte (18 h) a 37 °C con agitazione.
NOTA: Si raccomanda un minimo di tre repliche biologiche per l'uso nel modello di biofilm Flexipeg. - Normalizzare le colture a un OD600nmdi 0,1 (circa10,8 unità formanti colonie (CFU)/mL dopo la diluizione su piastra) in un volume finale di 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Impostazione e inoculazione della micropiastra
- Aliquotare 135 μl di urina umana aggregata (PHU) in ciascun pozzetto in prova in una piastra da 96 pozzetti, conformemente alla disposizione delle piastre nella Figura 1 (8). Ogni pozzetto rappresenta una replica tecnica (sono necessarie almeno n = 3 repliche tecniche per replicato biologico).
NOTA: I mezzi di urina artificiali (AUM) possono essere utilizzati al posto della PHU, se lo desiderano l'utente. - Inoculare ogni pozzetto durante il test con 15 μL della coltura notturna normalizzata, ottenendo un volume finale del pozzetto di 150 μL. Riservare almeno 100 μL di coltura notturna normalizzata per diluizioni seriali per convalidare le CFU/mL dell'inoculo.
- Preparare i controlli negativi aliquotando 150 μL di PHU sterile solo nei pozzetti pertinenti.
- Dopo la configurazione della micropiastra, inserire i pioli nei rispettivi pozzetti (come determinato prima della sterilizzazione in autoclave dei pioli) e assicurarsi che il coperchio del piolo sia a filo con la superficie della piastra. Coprire il coperchio del piolo con il coperchio della micropiastra, tenendolo in posizione con del nastro adesivo per autoclave se necessario.
- Posizionare i modelli di pioli in una vasca/sacchetto di plastica sigillato con un rotolo blu umido per evitare l'evaporazione e incubare staticamente per 24 ore a 37 °C.
- Validazione dell'inoculo
- Aliquotare 180 μL di PBS nelle righe 2-6 della prima colonna di una micropiastra da 96 pozzetti e aggiungere i 100 μL riservati di coltura notturna normalizzata nel primo pozzetto.
- Rimuovere 20 μl della coltura notturna normalizzata dal primo pozzetto e aliquotare nel secondo pozzetto, pipettando delicatamente su e giù per mescolare.
- Ripetere il passaggio 3.3.2 fino a quando l'inoculo iniziale non è stato diluito fino al pozzetto finale (1 × 105).
- Piastra 10 μL di spot di ciascuna diluizione su un terreno solido appropriato in triplicato. Incubare staticamente per una notte a 37 °C.
- Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie in ciascun punto per calcolare l'effettivo CFU/mL dell'inoculo.
4. Quantificazione del biofilm
- Elaborazione dei pioli
- Dopo l'incubazione, rimuovere il modello di piolo dalla micropiastra e capovolgerlo sotto una fiamma o all'interno di una cabina di sicurezza microbica (pioli rivolti verso l'alto). Scartare le micropiastre.
- Trasferire il coperchio del peg in una micropiastra fresca contenente 180 μl di aliquote di PBS sterile per rimuovere eventuali cellule non aderenti. Ripetere due volte in PBS fresco per un totale di tre fasi di lavaggio.
NOTA: Per evitare danni ai biofilm associati alla superficie, evitare di rompere i pioli quando si rimuove il coperchio del piolo da ciascuna micropiastra (ad esempio, toccando i bordi del pozzetto).
- Enumerazione di CFU/mL (associata a biofilm)
- Lavorando in modo asettico sotto una fiamma o in una cappa di sicurezza microbiologica, allestire il rack per provette (prodotto al punto 1.2) con provette di vetro sterili come mostrato nella Figura 1 e fissare la parte superiore del rack che si adatta al coperchio del piolo.
- In modo asettico, aliquotare 600 μL di PBS sterile in ciascuna provetta.
- Posizionare il coperchio del piolo nel rack, con i pioli in linea con le provette nel rack. Rimuovere il nastro adesivo per autoclave dal coperchio del piolo.
- Utilizzando una pinza sterile, spingere i perni attraverso il coperchio del piolo e nelle provette corrispondenti allineate di seguito.
- Riposizionare i coperchi delle provette e agitare ogni provetta per 60 s per disaggregare le cellule associate al biofilm dalla superficie del piolo.
- Rimuovere 100 μl da ciascuna provetta e diluire in serie come descritto in precedenza nella fase 3.3 in PBS sterile.
- Utilizzando una piastra per pipetta sierologica, individuare 10 μL di ciascuna diluizione su un terreno solido appropriato e incubare staticamente a 37 °C per una notte.
- Dopo l'incubazione, contare il numero di colonie su ciascuna piastra di diluizione e utilizzarlo per calcolare le CFU/mL.
- Colorazione cristallovioletto
- Aliquotare 180 μl di cristallovioletto allo 0,1% (p/v) (in acqua sterile) nei 24 pozzetti di prova di una micropiastra a 96 pozzetti.
- Inserire il modello di piolo risciacquato (pioli e coperchio del piolo) nei pozzetti corrispondenti della micropiastra. Incubare staticamente a temperatura ambiente per 20 min.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il modello di piolo dalla micropiastra e gettare la micropiastra.
- In una vasca di dimensioni adeguate, sciacquare l'intero piolo installato in acqua di rubinetto agitando delicatamente. Ripeti tre volte.
- Capovolgere il modello a pioli e lasciare che i pioli si asciughino completamente a RT.
- Aliquotare 180 μl di acido acetico al 30% in una micropiastra fresca a 96 pozzetti e inserire il modello di pioli essiccato nei pozzetti corrispondenti. Incubare a RT per 30 min.
- Rimuovere il modello a pioli dalla micropiastra e leggere il diametro esterno di540 nm dei pozzetti colorati utilizzando un lettore di micropiastre o uno spettrofotometro.
- Per calcolare la formazione di biofilm sui pioli, calcolare la media del diametro esternodi 540 nm dei pioli di controllo negativi colorati e sottrarre dalla media dei pioli di prova.
