Purificazione di vettori adenovirali contenenti genoma basata su cloruro di cesio

Abstract

Fonte: Ehrke-Schulz, E., et al. Clonaggio e produzione su larga scala di vettori adenovirali ad alta capacità basati sul tipo 5 di adenovirus umano. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video illustra la purificazione di vettori adenovirali ad alta capacità mediante ultracentrifugazione in gradiente di cloruro di cesio, consentendo la separazione di virioni contenenti il genoma per applicazioni nel trasferimento genico, nella caratterizzazione dei vettori e negli studi terapeutici preclinici

Protocollo

1. Purificazione e dialisi di HCAdV (vettori adenovirali ad alta capacità)
   1. Per preparare il lisato virale per gradienti al cloruro di cesio (CsCl), congelare la sospensione di cellule e virus in azoto liquido e scongelare a bagnomaria a 37 °C per 4 cicli.
   2. Centrifugare il lisato virale a 500 x g per 8 min a temperatura ambiente (RT) e raccogliere il soprannatante contenente gli HCAdV (vettori adenovirali ad alta capacità).
   3. Per l'ultracentrifugazione, preparare le soluzioni di CsCl come segue. Pesare rispettivamente 37,5 g (per 1,5 g/cm³), 33,5 g (per 1,35 g/cm³) e 31,25 g (per 1,25 g/cm³) di polvere di CsCl e portare a volume con dH₂O fino a 25 ml.
      1. Agitare fino a ottenere una soluzione limpida e filtrare sterilmente le soluzioni. Alla fine, prelevare 1 ml di ciascuna soluzione e pesarlo su una bilancia analitica per verificare che la densità sia corretta. 1 ml dovrebbe pesare rispettivamente 1,5 g, 1,35 g e 1,25 g.
      2. Se la densità è troppo elevata, regolarla aggiungendo gradatamente piccoli volumi (µl) di dH₂O sterile. Dopo l'aggiunta di dH₂O, misurare nuovamente la densità. Se necessario, aggiungere ulteriore dH₂O.
      3. Ripetere la procedura finché la densità non è corretta. Se la densità è troppo bassa, regolarla aggiungendo una piccola quantità di polvere di CsCl. Filtrare nuovamente sterilmente e verificare la densità. Se la densità è ancora troppo alta, regolarla aggiungendo dH₂O come descritto in precedenza. Se la densità è ancora troppo bassa, aggiungere altro CsCl, filtrare nuovamente sterilmente e verificare la densità. Ripetere la procedura finché la densità non è corretta.
   4. Preparare gradienti a step di CsCl in 6 tubi trasparenti per ultracentrifuga. Pipettare con attenzione e lentamente le soluzioni di CsCl nei tubi nel seguente ordine: 0,5 ml di soluzione di CsCl a 1,5 g/cm³, 3 ml di soluzione di CsCl a 1,35 g/cm³ e 3,5 ml di soluzione di CsCl a 1,25 g/cm³ (Figura 1C).
   5. Sovrapporre circa 4,5 ml del soprannatante purificato del vettore ottenuto al punto 1.2 sullo strato di CsCl a 1,25 g/cm³. Centrifugare i gradienti in un'ultracentrifuga con rotore a pendolo (SW-41) a 12 °C per almeno 2 ore a 226.000 x g (35.000 giri/min) con accelerazione e decelerazione lente per separare le particelle virali contenenti il genoma HCAdV dalle particelle vuote e dai detriti cellulari.
      NOTA: In condizioni ottimali si forma una banda diffusa di detriti cellulari in cima ai tubi. Al di sotto, si possono osservare due bande bianche. La banda superiore contiene particelle vuote, mentre la banda inferiore corrisponde all'HCAdV (Figure 1C e 2A).
   6. Rimuovere con attenzione gli strati di detriti cellulari e particelle vuote e raccogliere 1 ml della banda inferiore da ciascun tubo, trasferendo il virus con una punta di pipetta pulita in un tubo sterile da 50 ml. Aggiungere fino a 24 ml di soluzione di CsCl a 1,35 g/cm³ alle particelle virali raccolte e mescolare delicatamente.
   7. Riempire i tubi per centrifuga con la soluzione di virus in CsCl a 1,35 g/cm³ fino all'orlo e centrifugare O/N (notte intera) (18-20 h) a 226.000 x g (35.000 giri/min) a 12 °C in un'ultracentrifuga con rotore a pendolo (SW-41) con accelerazione e decelerazione lente.
   8. Raccogliere l'HCAdV presente nella banda inferiore ben definita. Poiché una eventuale banda superiore contiene particelle vuote, rimuovere gli strati superiori partendo dall'alto con una pipetta (vedere Figure 1C e 2B). Successivamente, prelevare la banda inferiore con una pipetta.
   9. Dializzare le particelle virali raccolte per lo scambio di tampone.
      1. Tagliare un tratto di tubo da dialisi (cutoff molecolare: 50.000) di circa 8 cm di lunghezza, lavarlo con dH₂O sterile per 3 volte. Chiudere quindi un'estremità del tubo da dialisi con una molletta di plastica e trasferire il virus raccolto al punto 5.8 all'interno del tubo usando una pipetta da 1 ml. Evitare bolle d'aria all'interno del tubo e chiuderlo sull'altro lato con una molletta per dialisi.
      2. Dializzare in 1 L di tampone di dialisi (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glicerolo e 1 mM MgCl₂ (cloruro di magnesio) in H₂O deionizzata) per 2 ore a 4 °C con agitazione lenta. Sostituire il tampone di dialisi con 2 L di tampone fresco e dializzare O/N a 4 °C con agitazione lenta. In alternativa, utilizzare un tampone al saccarosio (140 mM NaCl (cloruro di sodio), 5 mM Na₂HPO₄·2H₂O (fosfato bialcalino di sodio), 1,5 mM KH₂PO₄ (fosfato monopotassico) e 730 mM saccarosio, pH 7,8).
      3. Raccogliere le particelle virali dializzate al punto 1.9.2. usando una pipetta da 1 ml. Preparare diverse aliquote di piccoli volumi desiderati (25-100 µl) e conservare il virus purificato a -80 °C.

Risultati

Figura 1. Risultati rappresentativi della procedura di clonaggio e del rilascio del genoma del vettore adenovirale ad alta capacità (HCAdV) da pAdVFTC. (A) Rilascio del cassetto di espressione del gene d'interesse (GOI) da pHM5 mediante digestione con PI-SceI e I-CeuI. (B) Cassetto di espressione del GOI purificato e pAdVFTC purificato e deprivato di gruppi fosfato, digeriti rispettivamente con PI-SceI e I-CeuI. (C) Digestione analitica con HincII di cloni di pAdVFTC con e senza GOI. (D) Rilascio del genoma HCAdV contenente il GOI da pAdVFTC-GOI mediante digestione con NotI

Figura 2. Risultati rappresentativi dopo la centrifugazione in gradiente di cloruro di cesio (centrifugazione in gradiente di CsCl (A) Dopo aver eseguito un gradiente a gradini (vedere anche punto 1.5); (B) Dopo il gradiente continuo (vedere anche il passaggio 1.7).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi ultracentrifuga Ultra Clear	Beckmann Coulter	344059	centrifugazione in gradiente di densità
Ultracentrifuga	Beckmann Coulter		centrifugazione in gradiente di densità
Rotore SW-41	Beckmann Coulter		centrifugazione in gradiente di densità
Membrana Spectrapor Spectrum Laboratories	VWR	132129	tubulino per dialisi
Cassette per dialisi pronte all'uso	Thermo	66383	dialisi
Cloruro di cesio	Carl Roth	8627.1	centrifugazione in gradiente di densità
Mezzo LB	Carl Roth	X968.3	mezzo di crescita batterica
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	tampone per dialisi/tampone per lisi
Glicerolo 99,5%	Carl Roth	3783.1	tampone per dialisi
MgCl₂ 98,5%	Carl Roth	KK36.2	tampone per dialisi
NaCl	Carl Roth	3957.1	tampone per dialisi opzionale
KH₂PO₄	Carl Roth	3904.2	tampone per dialisi opzionale
Saccarosio	Carl Roth	9286.1	tampone per dialisi opzionale
Na₂HPO₄·2H₂O	Carl Roth	4984.2	tampone per dialisi opzionale
Tubi da 1,5 ml	sarstedt	72,730,005	conservazione dei preparati virali a -80 °C