Il video dimostra un metodo per l'iniezione intramiocardica guidata da ultrasuoni di un vettore virale ricombinante in un modello murino. Questa tecnica consente un'efficace somministrazione mirata di geni al cuore per lo studio degli effetti dell'espressione del transgene sulla funzione cardiaca.
Articolo metodologico
Veicolazione virale di geni nel cuore di topo per la valutazione degli effetti genici sulla funzione cardiaca
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31 agosto 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Espressione virale del transgene nei tessuti ventricolari di roditore
NOTA: Conservare l'adenovirus ricombinante o il virus adeno-associato (AAV) che esprime il gene bersaglio e il corrispondente virus di controllo, come Ad-GFP (proteina fluorescente verde) (titolo di 1 x 1010 unità formanti placche [PFU]/mL) o AAV9-GFP (titolo di 1 x 1013 copie genomiche [GC]/mL) (vedere Tabella dei Materiali), in un congelatore a −80 °C80 °C congelatore
- Nel giorno dell'iniezione del virus, scongelare il virus sul ghiaccio. Aspirare il virus che esprime il gene bersaglio e il virus di controllo in due siringhe separate (volume = 50 µL) con aghi da 30 G ½ e mantenere sul ghiaccio fino all'uso.
NOTA: Eventuali bolle d'aria nella siringa e nell'ago devono essere rimosse con attenzione. - Somministrare buprenorfina a ratti o topi (0,05 mg/kg per i ratti, 0,1 mg/kg per i topi, per via sottocutanea); un'ora dopo, indurre l'anestesia con isoflurano al 3% e mantenere l'isoflurano al 2% (in ossigeno al 100% con flusso di 0,5-1,0 L/min) per la procedura successiva.
- Pizzicare delicatamente il corpo dell'animale (ad esempio, la coda) con un paio di pinzette e, se l'animale non risponde al pizzicamento con alcun movimento corporeo, si conferma un'adeguata anestesia.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 °C utilizzando un tappetino riscaldante elettrico. Rasare i peli nella regione toracica utilizzando un tagliacapelli.
NOTA: Occorre prestare attenzione durante l'uso del tappetino riscaldante elettrico a causa della possibile distribuzione non uniforme del calore. - Applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea.
- Mantenere l'animale in posizione supina e utilizzare un sistema di imaging preclinico (vedere Tabella dei Materiali) per l'imaging ecografico del cuore dell'animale in orientamento all'asse corto.
NOTA: I passaggi seguenti vengono eseguiti all'interno di un armadio di sicurezza di livello II, che garantisce un ambiente sterile. Vengono adottate procedure di sicurezza standard, comprese quelle relative alla manipolazione sicura degli aghi. - Sterilizzare la regione toracica inferiore sinistra dell'animale alternando tre cicli circolari di soluzione disinfettante a base di iodio o clorhexidina e alcol.
- Sotto guida ecografica, inserire l'ago da 30 G 1/2 della siringa contenente il virus preparato al punto 1.1. nel torace dell'animale attraverso il lato toracico inferiore sinistro del corpo.
- Avvicinare la punta dell'ago alla parete anteriore libera del ventricolo sinistro e iniettare lentamente 10-15 μL del virus. Verificare l'avvenuta iniezione mediante le immagini ecografiche osservando un aumento della luminosità vicino alla punta dell'ago.
NOTA: La quantità di virus iniettata in ciascun sito non deve superare i 15 μL per evitare danni fisici ai tessuti miocardici. - Rimuovere l'ago dal cuore e inserirlo in altre regioni del ventricolo sinistro per una seconda e una terza iniezione della stessa quantità di virus.
NOTA: Il numero totale di siti di iniezione è determinato dal disegno sperimentale. Se è richiesta un'espressione focale del transgene, è sufficiente una singola iniezione; se è richiesta un'espressione del transgene più diffusa, sono generalmente necessari più siti di iniezione (da tre a cinque). - Al termine delle iniezioni, riportare l'animale nella sua gabbia.
- Sorvegliare attentamente l'animale finché non abbia riacquistato una coscienza sufficiente a mantenere la decubito sterno e riportarlo nella sua stanza di alloggio.
- Somministrare cloridrato di buprenorfina (0,1 mg/kg, due volte al giorno per i topi, 0,05 mg/kg, due volte al giorno per i ratti, per via sottocutanea) all'animale per i successivi 2 giorni. Riportare gli animali nel vivario e monitorarli quotidianamente per eventuali segni insoliti di dolore o malessere e, se necessario, trattarli secondo i protocolli del comitato istituzionale per la cura degli animali.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ago PrecisionGlide 30 G ½ | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| Adeno-associated virus (AAV9 che esprime la proteina fluorescente verde (GFP)) | Vector Biolabs | 7007 | |
| Adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| Cappa a sicurezza biologica (Livello II) | Microzone Corporation | N/A | Modello #: BK-2-4 |
| Buprenorfina | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Tagliacapelli | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Siringa Hamilton | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Pad riscaldante | Life Brand | E12107 | |
| Isoflurano | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Topi (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Topi (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Unguento oftalmico | Systane | DIN 02444062 | |
| Ratto (Sprague-Dawley, maschio) | Charles River | 400 | |
| Lame da bisturi | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Manico da bisturi | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Sistema di imaging preclinico VEVO3100 | VisualSonic Inc. | N/A |
