Trasduzione di un fegato di ratto umanizzato mediante vettori virali adeno-associati

Abstract

Fonte: Hiller, T., et al. Studio di vettori virali in un modello tridimensionale di fegato ripopolato con la linea cellulare di carcinoma epatocellulare umano HepG2. J. Vis. Exp., (2016)

Questo video dimostra la consegna genica mediata da virus adeno-associati in un impalcatura di fegato di ratto umanizzato. Il vettore trasferisce un transgene che codifica per un reporter fluorescente e un RNA di silenziamento genico nelle cellule epatiche mediante endocitosi mediata da recettore. Questo modello supporta una trasduzione efficiente in un sistema tessutale epatico tridimensionale perfuso.

Protocollo

Trasduzione del modello epatico

1. Regolare la soluzione del vettore virale adeno-associato (AAV) a una concentrazione finale di 2,7 x 10¹³ genomi del vettore in 5 ml aggiungendo il volume corrispondente di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS).
2. Staccare il fegato dal circuito del mezzo di coltura rimuovendo il tubo dalla cannula. Collegare una siringa da 5 ml alla cannula della vena porta e iniettare l'intera soluzione del vettore AAV (5 ml).
3. NOTA: Opzionalmente, aggiungere fenolo rosso (5 µg/ml) per seguire la distribuzione della soluzione del vettore AAV in tutto il fegato.
4. Incubare per 1 ora senza pompaggio. Aumentare gradualmente la portata, iniziando con 1,25 ml/min per 10 minuti; 2,5 ml/min per 20 minuti e 3,75 ml/min per 30 minuti. Coltivare il fegato di ratto recellularizzato per 6 giorni.
5. NOTA: Sostituire un terzo del mezzo con mezzo fresco (50 ml) ogni due giorni. Prelevare campioni del mezzo di coltura per misurare parametri fisiologici, come l'attività della lattato deidrogenasi, il pH dei campioni di mezzo e la concentrazione di glucosio e lattato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatrice	Fraunhofer	/
Pompa peristaltica	Fraunhofer	/
Flangia con scanalatura	Duran	2439454
O-Ring trasparente	Duran	2922551
Morsetto a sgancio rapido	Duran	2907151
Coperchio a flangia piatta	Duran	2429857
Tubo filettato	Duran	2483802
Tubo filettato	Duran	2483602
Anello di tenuta in silicone	Duran	2862012
Tappo a vite	Duran	2924013
Tappo a vite	Duran	2924008
Tappo a vite con apertura	Duran	2922709
Tappo a vite con apertura	Duran	2922705
Filtro	Sarstedt	831,826,001
Tubazione in silicone	VWR	228-1500
Connettore per tubo	Ismatec	ISM556A
Tubazione biocompatibile	Ismatec	SC0736
Flaconi da coltura T175	Greiner bio-one	660 160
RPMI 1640	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0501-500
glutammina	BioWest SAS (Th. Geyer)	X0551-100
Tripsina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0940-100
penicillina/streptomicina	BioWest SAS (Th. Geyer)	L0022-100
Serum fetale bovino	cc pro	S-10-M
HepG2	DSMZ	ACC 180