Conferma della trasduzione virale in fegato di ratto ricellularizzato mediante colorazione immunoistochimica

Abstract

Fonte: Hiller, T. et. al. Studio di Vettori Virali in un Modello Tridimensionale di Fegato Ripopolato con la Linea Cellulare di Carcinoma Epatocellulare Umano HepG2. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video dimostra la colorazione immunohistochimica per valutare il trasferimento genico virale in un modello di fegato di ratto ricellularizzato. L'espressione del gene reporter, confermata mediante rilevamento con anticorpi e co-localizzazione con la colorazione nucleare, indica un'avvenuta trasduzione virale nelle cellule.

Protocollo

1. Trasduzione del Fegato di Ratto Ricostruito

1. Produzione su larga scala di vettori virali derivati da virus adeno-associati (vettore AAV)
   1. Produce, purifica e quantifica i vettori AAV:
      1. Produce brevemente i vettori AAV in bottiglie rotanti e purificali mediante centrifugazione su gradiente di iodixanolo. Rimuovi l'iodixanolo residuo mediante filtrazione su colonne di filtrazione su gel PD10. Determina la concentrazione del vettore AAV mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) utilizzando il DNA genomico dell'AAV come standard.
         NOTA: Il vettore AAV2/6 pseudotipizzato autocomplementare utilizzato nel presente studio codificava per la proteina fluorescente verde smeraldo, EmGFP, come marcatore per dimostrare l'efficienza di trasduzione e un cassette espressivo per RNA a forcina corta (shRNA) per l'abbattimento di un gene espresso endogenamente (ciclofilina B umana (hCycB), Figura 1). Assicurati una quantità sufficiente di vettori scAAV pseudotipizzati del sierotipo 6 (2,7 x 10¹³ vettori AAV per modello di fegato).
2. Trasduzione del modello di fegato
   1. Regola la soluzione del vettore AAV a una concentrazione finale di 2,7 x 10¹³ genomi del vettore in 5 mL aggiungendo il volume corrispondente di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS).
   2. Disconnetti il fegato dal circuito del mezzo rimuovendo il tubo dalla cannula. Collega una siringa da 5 mL alla cannula della vena porta e inietta l'intera soluzione del vettore AAV (5 mL).
      NOTA: In alternativa, aggiungi fenolo rosso (5 µg/ml) per seguire la distribuzione della soluzione del vettore AAV in tutto il fegato.
   3. Incuba per 1 ora senza pompaggio. Aumenta gradualmente la portata, iniziando con 1,25 ml/min per 10 minuti; 2,5 ml/min per 20 minuti e 3,75 ml/min per 30 minuti. Coltiva il fegato di ratto ricellularizzato per 6 giorni.

2. Valutazione del Fegato di Ratto Ricostruito e Transdotto

1. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE) e analisi immunohistochimica
   1. Prelevare campioni (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) da ciascun lobo epatico utilizzando un bisturi.
   2. Incubare i campioni in soluzione di paraformaldeide al 4% (PFA) + saccarosio al 4% per 1,5 ore a 4 °C. (Attenzione: la PFA è tossica e cancerogena. Conservare sempre la PFA all'interno di una cappa aspirante e indossare idonei indumenti protettivi.) Lavare tre volte con PBS (1 minuto per ogni passaggio di lavaggio) e incubare in saccarosio all'8% tutta la notte a 4 °C.
   3. Versare il mezzo di fissazione in stampi crioplastici in plastica e posizionare i campioni nel mezzo di fissazione, eliminando le bolle d'aria. Aggiungere mezzo di fissazione fino a coprire completamente il campione. Conservare i campioni inclusi a -80 °C fino all'uso successivo.
   4. Preparare sezioni crio (10 µm) con un criostato. Valutare la ricellularizzazione mediante colorazione con ematossilina ed eosina. Valutare l'efficienza di trasduzione mediante colorazione immunohistochimica per il gene di interesse (in questo caso: EmGFP).

Risultati

Figura 1. Mappa del vettore AAV2/6 pseudotipizzato autocomplementare utilizzato nel presente studio. Il genoma è costituito dalle ripetizioni terminali invertite (ITR) dell'AAV2 e codifica per EmGFP sotto il controllo del promotore CMV, nonché per un shRNA sotto il controllo di un promotore U6.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tissue-Tek O.C.T.	Weckert-Labortechnik	600001
Cryoforma 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566
Incubatrice	Fraunhofer	/