Generazione di cellule con knockdown condizionale mediante un sistema di espressione lentivirale di shRNA responsive alla tetraciclina

Abstract

Fonte: Kubala, M. H. & DeClerck, Y. A. Silenziamento Condizionale dell'Espressione Genica in Linee Cellulari Tumorali per lo Studio del Reclutamento di Monociti/Macrofagi nel Microambiente Tumorale. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video illustra la generazione di linee cellulari tumorali con silenziamento genico indotto mediante un sistema lentivirale con shRNA inducibile da Tet. Vengono descritti i passaggi per la trasduzione virale, la selezione antibiotica e il silenziamento genico indotto da doxiciclina.

Protocollo

1. Generazione di linee cellulari stably transdotte
   1. Piattiare le cellule di cancro del colon HCT116 e le cellule di cancro al seno MDA-MB-231 a 50.000 cellule/pozzetto in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10% e penicillina/streptomicina (Pen/Strep) all'1% in una piastra a 12 pozzetti. Incubare a 37 °C e 5% CO₂ fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 60-70%.
   2. Lavare le cellule con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) e aggiungere 1 mL di mezzo contenente il virus alle cellule tumorali, quindi incubare tutta la notte a 37 °C e 5% CO₂. Come controllo, aggiungere 1 mL di mezzo DMEM fresco integrato con FBS al 10% e Pen/Strep all'1% a 2 pozzetti con cellule tumorali.
   3. Rimuovere con attenzione il mezzo contenente il virus mediante aspirazione. Lavare le cellule con PBS e sostituire il mezzo con DMEM contenente FBS tetraciclina-libero (Tet-free) al 10% (v/v) e Pen/Strep all'1%.
   4. Dopo 72 h, lavare le cellule con PBS e cambiare il mezzo in DMEM con FBS Tet-free al 10%, Pen/Strep all'1%, e 1 µg/mL di puromicina per la selezione delle cellule transdotte con il virus.
      1. In base alla linea cellulare utilizzata, regolare la concentrazione di puromicina per una selezione ottimale testando un intervallo di concentrazioni di puromicina (0,1; 0,5; 1; 2 e 5 µg/mL) su cellule non transdotte e scegliendo la concentrazione più bassa alla quale nessuna cellula controllo sopravvive dopo 3 giorni di coltura.
   5. Selezionare le cellule transdotte con il virus coltivandole in presenza di puromicina per 3-14 giorni. Come controlli, preparare due ulteriori pozzetti con cellule non transdotte, uno con mezzo contenente puromicina e uno senza puromicina. Osservare l'effetto parziale di morte cellulare indotto dalla puromicina nel pozzetto con cellule transdotte rispetto ai pozzetti di controllo.
      NOTA: Le cellule non transdotte non cresceranno in presenza di puromicina.
   6. Verificare l'efficienza del knockdown condizionale (KD) nelle cellule di cancro al colon HCT116 e nelle cellule di cancro al seno MDA-MB-231 resistenti alla puromicina.
      NOTA: La concentrazione efficace di doxiciclina varierà a seconda della linea cellulare utilizzata e deve essere titolata (tipicamente tra 100 ng/mL e 2 µg/mL).
      1. Determinare la concentrazione di doxiciclina che non risulta tossica per le cellule ma efficace nel ridurre l'espressione della proteina d'interesse. In questo protocollo, 1 µg/mL è stata utilizzata con successo in vitro.
      2. Coltivare le cellule per 72 h in presenza e in assenza di 0,1, 1 e 2 µg/mL di doxiciclina. Verificare il livello di espressione della proteina ridotta (in questo caso, inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1 (PAI-1)) nel lisato cellulare mediante analisi Western blot. Confrontare le cellule HCT116 e MDA-MB-231 che esprimono in modo condizionale RNA a corto stelo (shRNA) con le cellule di controllo con shRNA randomizzato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vettore lentivirale Tet-pLKO-puro	Addgene	21915
FBS (privi di tetraciclina)	Omega Scientific	FB-15
Vettore psPAX	Addgene	12260
Vettore pMD2.G	Addgene	12259
Cellule HEK293	ATCC	CRL-1573
PBS	Corning	21-031-CV
Mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM)	Corning	10-013-CV
Soluzione salina fosfato-tampone (PBS)	Corning	21-031-CV
4-(2-idrossietil)-1-piperazinaetansolfonico (HEPES)	Sigma-Aldrich	H3375
Puromicina	Sigma-Aldrich	P9620
Cloridrato di doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-25g
Istituto Roswell Park per la Ricerca sul Cancro (RPMI)	Corning	10-040-CV
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122