Preparazione di una sospensione arricchita di virus mediante centrifugazione a gradiente di saccarosio

Abstract

Fonte: Vijayraghavan, S. e Kantor, B. Un protocollo per la produzione di vettori lentivirali privi di integrasi per l'inattivazione genica mediata da CRISPR/Cas9 in cellule in divisione. J. Vis. Exp., (2017)

Questo video illustra un metodo di ultracentrifugazione in due passaggi che utilizza gradienti e cuscini di saccarosio per purificare e concentrare le particelle virali dal sopranatante di colture cellulari. La procedura consente la separazione in base alla densità di galleggiamento, permettendo il recupero di virus integri adatti per applicazioni successive.

Protocollo

1. Concentrazione di Particelle Virali mediante Ultracentrifugazione

NOTA: Utilizziamo un metodo di purificazione a doppio saccarosio che prevede due passaggi: uno step con gradiente di saccarosio e uno step con cuscinetto di saccarosio (Figura 1).

1. Caricare i tubi conici per ultracentrifugazione nell'ordine seguente per creare un gradiente di saccarosio: 0,5 mL di saccarosio al 70% (sciolto in soluzione salina fosfato 1x [PBS]), 0,5 mL di saccarosio al 60% (sciolto in DMEM), 1 mL di saccarosio al 30% (sciolto in Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]) e 2 mL di saccarosio al 20% (sciolto in PBS 1x).
2. Aggiungere con attenzione il surnatante contenente il virus al gradiente. Poiché il volume totale del surnatante proveniente da quattro piastre da 15 cm è di 100 mL, utilizzare sei tubi per ultracentrifugazione per ogni centrifugazione per processare l'intero volume del surnatante virale.
   1. Ogni tubo per ultracentrifugazione utilizzato in questo passaggio ha una capacità volumetrica fino a 30 mL (incluso il volume di saccarosio). Distribuire il surnatante virale in modo uniforme tra i tubi, lasciando almeno il 10% di spazio libero per evitare fuoriuscite.
   2. Regolare il volume di coltura a circa 20 - 22 mL per piastra quando si utilizzano più di quattro piastre da 15 cm per ciascun esperimento, in modo che il volume finale del surnatante virale raccolto possa essere facilmente contenuto in sei tubi per ultracentrifugazione.
   3. Riempire i tubi per ultracentrifugazione fino ad almeno tre quarti della loro capacità totale; in caso contrario, durante la centrifugazione potrebbe verificarsi la rottura dei tubi, con conseguente possibile perdita del campione e/o danni all'apparecchiatura.
3. Bilanciare i tubi con PBS 1x e centrifugare i campioni a 70.000 x g per 2 h a 17 °C
   NOTA: Per evitare il disturbo dello strato di saccarosio durante l'accelerazione, impostare l'ultracentrifuga in modo da accelerare lentamente il rotore fino a 200 giri/min nei primi 3 min della centrifugazione. Analogamente, impostare l'ultracentrifuga in modo da decelerare lentamente il rotore da 200 a 0 giri/min nell'arco di 3 min alla fine della centrifugazione.
4. Raccogliere con attenzione le frazioni di saccarosio al 30 - 60% in tubi puliti (Figura 1). Aggiungere PBS 1x freddo alle frazioni raccolte e portare il volume a 100 mL; mescolare aspirando e rilasciando più volte con una pipetta.
5. Procedere al passaggio del cuscino di saccarosio stratificando attentamente il preparato virale su un cuscino di saccarosio. A tale scopo, aggiungere 4 mL di saccarosio al 20% (in PBS 1x) al tubo, seguiti da circa 20 - 25 mL di soluzione virale per tubo. Se i tubi sono meno che pieni per tre quarti, completare con PBS 1x sterile.
6. Bilanciare con attenzione e centrifugare i campioni a 70.000 x g per 2 h a 17 °C, come in precedenza. Versare il surnatante e lasciare defluire il liquido residuo capovolgendo i tubi su salviette di carta.
7. Aspirare le gocce residue per rimuovere tutto il liquido dal pellet. A questo punto, i pellet contenenti il virus dovrebbero essere appena visibili come piccole macchie traslucide.
8. Risospendere i pellet aggiungendo 70 µL di PBS 1x al primo tubo e pipettando accuratamente la sospensione, trasferendo successivamente la sospensione al tubo successivo e mescolando come in precedenza, continuando finché tutti i pellet non sono risospesi.
9. Risciacquare i tubi con ulteriori 50 µL di PBS 1x freddo e mescolare come in precedenza. Assicurarsi che il volume totale della sospensione finale sia di circa 120 µL e appaia leggermente lattescente; chiarire per centrifugazione a 10.000 x g per 30 s su una microcentrifuga da banco.
10. Trasferire il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga, preparare aliquote da 10 µL e conservarle a -80 °C.
    NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento sui campioni lentivirali. Tranne quando richiesto dalla centrifugazione, si raccomanda di eseguire i passaggi rimanenti in cappe per colture cellulari o in stanze designate per colture cellulari, adottando adeguate misure di sicurezza biologica.

Risultati

Figura 1: Concentrazione delle particelle virali mediante protocollo a gradiente di saccarosio doppio. Le particelle virali raccolte dal sopranatante (SN) vengono caricate sul gradiente di saccarosio. Soluzioni di saccarosio al 70%, 60%, 30% e 20% vengono utilizzate per creare il gradiente. Dopo la centrifugazione, le particelle raccolte dalle frazioni di saccarosio 30-60% vengono ulteriormente caricate su un cuscino di saccarosio al 20% e precipitate. Il pellet finale contenente le particelle virali purificate viene risospeso in 1x PBS per utilizzi successivi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura
Ultracentrifuga Optima XPN-80	Beckman Coulter	A99839
Centrifuga da banco Allegra 25R	Beckman Coulter	369434
Provette coniche per ultracentrifugazione	Seton Scientific	5067
Adattatori per provette coniche	Seton Scientific	PN 4230
Rotore a cestelli oscillanti SW32Ti	Beckman Coulter	369650
Provette centrifuga coniche da 50 mL	Corning	430291
Pipette per colture cellulari, 25 mL	Corning	4489