Questo video illustra l'uso di un'ELISA per p24 per stimare i titoli virali di vettori lentivirali. Il saggio prevede la lisi delle particelle virali per liberare la p24, il suo isolamento mediante anticorpi specifici e la sua rivelazione tramite un sistema legato alla perossidasi che produce un cambiamento di colore misurabile. Confrontando i valori di assorbanza dei campioni con una curva standard, si quantifica il titolo virale.
Articolo metodologico
Valutazione del titolo lentivirale tramite saggio immunoenzimatico (ELISA)
73 visualizzazioni
⸱
31 agosto 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Stima dei Titoli Virali
- Metodo p24 (proteina della capside p24 del virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1) - saggio immunoenzimatico (ELISA)NOTA: Il saggio viene eseguito utilizzando piastre ad alta capacità di legame a 96 pozzetti seguendo le istruzioni del programma NIH AIDS Vaccine per il kit HIV-1 p24 Antigen Capture Assay (vedere Tabella dei Materiali) con modifiche.
- Il giorno successivo, lavare i pozzetti tre volte con 200 µL di Tween 20 0,05% in PBS freddo (soluzione PBS-T). Rivestire la piastra con 100 µL di anticorpo monoclonale anti-p24 diluito 1:1500 in PBS 1x e incubare tutta la notte a 4 °C.
- Per eliminare il legame non specifico, bloccare la piastra con 200 µL di BSA al 1% in PBS; lavare tre volte con 200 µL di Tween 20 0,05% in PBS freddo (soluzione PBS-T) per almeno 1 h a temperatura ambiente.
- Preparazione dei campioni: Per preparazioni di vettori concentrati, diluire 1 µL del campione 100 volte aggiungendo 89 µL di dd-H2O e 10 µL di Triton X-100 (concentrazione finale del 10%). Per preparazioni non concentrate, preparare campioni diluiti dieci volte (aggiungere 80 µL di dd-H2O e 10 µL di Triton X-100 (concentrazione finale del 10%) a 10 µL del campione).NOTA: I campioni possono essere conservati a -20 °C in questo passaggio per un periodo prolungato per un uso successivo.
- Preparare gli standard di HIV-1 mediante diluizione seriale due volte (con concentrazione iniziale di 5 ng/mL).
- Diluire i campioni concentrati (da stock pre-diluiti 1:100) in RPMI 1640 (mezzo Roswell Park Memorial Institute 1640) integrato con Tween 20 0,2% e BSA 1% per ottenere diluizioni 1:10.000, 1:50.000 e 1:250.000. Diluire i campioni non concentrati (da stock pre-diluiti 1:10) in RPMI 1640 integrato con Tween 20 0,2% e BSA 1% per ottenere diluizioni 1:500, 1:2500 e 1:12.500.
- Applicare i campioni sulla piastra in triplice replicato e incubare tutta la notte a 4 °C.
- Il giorno successivo, lavare i pozzetti sei volte e incubare a 37 °C per 4 h con 100 µL di anticorpo policlonale anti-p24 da coniglio diluito 1:1000 in RPMI 1640, 10% FBS, BSA 0,25% e siero murino normale (NMS) al 2%.
- Lavare sei volte come sopra e incubare a 37 °C per 1 h con IgG di capra anti-coniglio coniugata con perossidasi diluita 1:10.000 in RPMI 1640 integrato con 5% di siero caprino normale, 2% NMS, BSA 0,25% e Tween 20 0,01%.
- Lavare la piastra come sopra e incubare con il substrato per perossidasi TMB (3,3′,5,5′-tetrametilbenzidina) a temperatura ambiente per 15 min.
- Interrompere la reazione aggiungendo 100 µL di HCl 1 N. Misurare l'assorbanza dei campioni a 450 nm utilizzando un lettore di piastre per assorbanza.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti per p24 ELISA | |||
| Anticorpo monoclonale anti-p24 | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Standard HIV-1 | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Anticorpo policlonale anti-p24 da coniglio | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| IgG da capra anti-coniglio coniugata con perossidasi | Sigma Aldrich | 12-348 | Concentrazione di lavoro 1:1500 |
| Serum murino normale, sterile, 500 mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Serum da capra, sterile, 10 mL | Sigma | G9023 | Concentrazione di lavoro 1:1000 |
| Substrato perossidasi TMB | KPL | 5120-0076 | Concentrazione di lavoro 1:10,000 |
