Generazione di virus adeno-associati ricombinanti mediante trasfezione di plasmidi

Abstract

Fonte: Ding, J., et al. Preparazione di rAAV9 per sovraesprimere o silenziare geni nei cuori di topo. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video illustra la produzione di particelle virali ricombinanti di adeno-associated virus mediante trasfezione di plasmidi in cellule di mammifero. Mette in evidenza l'espressione coordinata delle proteine Rep, Cap e delle proteine ausiliarie che guidano la replicazione del genoma virale e l'assemblaggio del capside all'interno del nucleo.

Protocollo

1. Trasfezione di cellule HEK293 con plasmidi del virus adeno-associato ricombinante 9 (rAAV9)

1. Preparare una soluzione di polietilenimina (PEI) lineare a 1 µg/µl. Sciogliere la polvere di PEI in dH₂O privo di endotossine riscaldato a 70-80 °C. Dopo aver raffreddato a temperatura ambiente (RT), neutralizzare la soluzione a pH 7,0 con HCl 1 M. Sterilizzare per filtrazione (0,22 µm) la soluzione. Aliquotare la soluzione stock di PEI a 1 µg/µl (1.400 µl/tubo) e conservare la soluzione a -20 °C.
2. Coltivare le cellule HEK293 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con anidride carbonica (CO₂) al 5 ± 0,5%.
3. Al giorno 0, seminare le cellule HEK293 in dieci piastre da 150 mm da 18 a 20 ore prima della trasfezione, suddividendo cellule con confluenza > 90% in un rapporto di diluizione 1:2.
   NOTA: Al giorno 1, le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza del 90%.
4. Al giorno 1, trasfettare le cellule HEK293 con il plasmide rAAV9 (ad esempio, costrutti rAAV9.cTNT::GFP o rAAV6.U6::shRNA), il plasmide Ad-Helper e il plasmide AAV-Rep/Cap utilizzando PEI.
   1. Per 10 piastre di cellule con confluenza del 90%, mescolare 70 µg di plasmide AAV-Rep/Cap, 70 µg di plasmide rAAV9 e 200 µg di plasmide Ad-Helper in un tubo da centrifuga da 50 ml.
   2. Se le cellule presentano una confluenza inferiore, regolare proporzionalmente la quantità di DNA. Ad esempio, se le cellule hanno una confluenza del 75%, ridurre proporzionalmente la quantità di DNA (75/90 della quantità indicata al punto 1.4.1): mescolare 70 x 75/90 = 58,3 µg di plasmide AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58,3 µg di plasmide rAAV9 e 200 x 75/90 = 166,7 µg di plasmide Ad-Helper in un tubo da centrifuga da 50 ml.
   3. Aggiungere 49 ml di DMEM a temperatura ambiente (senza FBS) al tubo da 50 ml e mescolare accuratamente.
   4. Aggiungere 1.360 µl di soluzione di PEI in modo che il rapporto PEI:DNA (v/p) sia 4:1. Mescolare accuratamente. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti.
   5. Aggiungere 5 ml della miscela preparata al punto 1.4.4 a ciascuna piastra da 150 mm (50 ml della miscela per dieci piastre da 150 mm).
5. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C con CO₂ al 5 ± 0,5% per 60-72 ore.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polietilenimina, Lineare (PM 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, Polipropilene, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (quantità 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Mezzo DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Siero Fetale Bovino	Atlanta Biologicals	S11150
Vettore rAAV9	Penn Vector Core	P1967