Purificazione di particelle virali ricombinanti da cellule renali umane trasfettate

Abstract

Fonte: Ding, J. et. al., Preparazione di rAAV9 per sovraesprimere o silenziare geni nei cuori di topo. J. Vis. Exp. (2016)

In questo video viene mostrata la purificazione di particelle virali ricombinanti da cellule renali umane trasfettate. Il virus viene rilasciato mediante lisi per congelamento-scongelamento e purificato utilizzando gradienti di iodixanolo con filtrazione assistita da copolimeri a blocchi.

Protocollo

1. Trasfezione di cellule HEK293 con plasmidi di virus adeno-associato ricombinante 9 (rAAV9)
   1. Preparare 1 µg/µl di soluzione di polietilenimina lineare (PEI). Sciogliere la polvere di PEI in dH privo di endotossine₂O che è stato riscaldato a 70-80 °C. Dopo aver raffreddato a temperatura ambiente (RT), neutralizzare la soluzione a pH 7,0 con acido cloridrico 1 M (HCl). Filtrare in condizioni sterili (0.22 µm) la soluzione. Aliquotare il 1 µg/µl Soluzione madre di PEI (1,400 µl/tube) e conservare la soluzione a -20 °C.
   2. Coltivare le cellule HEK293 in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina/streptomicina. Coltivare le cellule in un 37 °C incubatrice con 5 ± 0,5% di anidride carbonica (CO₂)₂).
   3. Al giorno 0, seminare le cellule HEK293 in dieci piastre da 150 mm 18-20 ore prima della trasfezione mediante suddivisione > Cellule al 90% di confluenza in una diluizione 1:2.
      NOTA: Al giorno 1, le cellule dovrebbero raggiungere una confluenza del 90%.
   4. Al giorno 1, trasfettare le cellule HEK293 con il plasmide rAAV9 (ad esempio, costrutti rAAV9.cTNT::GFP o rAAV6.U6::shRNA), il plasmide Ad-Helper e il plasmide AAV-Rep/Cap utilizzando PEI.
      1. Per 10 piastre di cellule al 90% di confluenza, mescolare 70 µg del plasmide AAV-Rep/Cap, 70 µg plasmide pfrAAV9 e 200 µg di plasmide helper Ad in un tubo da centrifuga da 50 ml.
      2. Se le cellule sono meno confluenti, regolare la quantità di DNA proporzionalmente. Ad esempio, se le cellule sono al 75% di confluenza, ridurre la quantità di DNA in proporzione (75/90 della quantità indicata al passaggio 2.4.1): mescolare 70 x 75/90 = 58.3 µg di plasmide AAV-Rep/Cap, 70 x 75/90 = 58.3 µg di plasmide rAAV9 e 200 x 75/90 = 166.7 µg del plasmide Ad-Helper in un tubo da centrifuga da 50 ml.
      3. Aggiungere 49 ml di DMEM a temperatura ambiente (senza FBS) nel tubo da 50 ml e mescolare accuratamente.
      4. Aggiungere 1,360 µl di soluzione di PEI in modo che il rapporto PEI:DNA (v/p) sia 4:1. Mescolare accuratamente. Incubare a temperatura ambiente per 15-30 minuti.
      5. Aggiungere 5 ml della miscela preparata al punto 1.4.4 in ogni piastra da 150 mm (50 ml della miscela per dieci piastre da 150 mm).
   5. Coltivare le cellule in un 37 °C incubatrice con 5 ±0,5% CO₂ per 60-72 ore.
2. Raccolta delle cellule HEK293 transfezionate e purificazione dei vettori rAAV9
   1. Raccogliere le cellule 60-72 ore dopo la trasfezione. Staccare e sospendere le cellule nelle piastre aspirando e dispensando ripetutamente il mezzo di coltura. Trasferire tutte le sospensioni cellulari in provette sterili da 50 ml.
   2. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare con 5 ml di soluzione salina fosfato (PBS) in ogni tubo e combinare tutte le sospensioni cellulari in un unico tubo da 50 ml.
   3. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti. Eliminare il soprannatante. A questo punto, conservare il pellet cellulare a -80 °C oppure purificare immediatamente l'AAV dal pellet, come descritto nei passaggi 2.4-2.15.
   4. Preparare il buffer di lisi: cloruro di sodio (NaCl) 150 mM e cloridrato di tris(idrossimetil)aminometano (Tris-HCl, pH 8,0) 20 mM. Sterilizzare per filtrazione (0.22 µM). Conservare il tampone a 4 °C.
   5. Risospendere il pellet con 10 ml di buffer di lisi.
   6. Congelare il lisato a -80 °C o nel bagno di ghiaccio secco/etanolo, quindi scongelarlo a 37 °CVortexare per 1 minuto. Congelare e scongelare il lisato per 3 volte.
   7. Aggiungere cloruro di magnesio (MgCl₂)₂) alla lisato scongelato (portare la concentrazione finale di MgCl₂ nel lisato sia di 1 mM). Aggiungere la nucleasi a una concentrazione finale di 250 U/ml. Incubare a 37 °C per 15 min per sciogliere l'aggregazione di DNA/proteine.
      NOTA: Se l'aggregazione di DNA/proteine non si dissolve dopo il trattamento con nuclease o endonuclease, omogenizzare i lisati con un omogenizzatore Dounce per 20 volte.
   8. Centrifugare il campione a 4.800 x g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il soprannatante.
   9. Nel frattempo, preparare la soluzione per il gradiente di iodixanolo:
      1. Preparare la soluzione al 17% del gradiente mescolando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di MgCl 1 M₂, 0,125 ml di cloruro di potassio (KCl) 1 M, 10 ml di NaCl 5 M e 12,5 ml di mezzo per gradiente di densità. Aggiustare il volume totale a 50 ml utilizzando H₂O.
      2. Preparare la soluzione al 25% mescolando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di MgCl 1 M₂, 0,125 ml di KCl 1 M, 20 ml di mezzo per gradiente di densità e 0,2 ml di Rosso Fenolo allo 0,5% (p/v). Portare il volume totale a 50 ml utilizzando H₂O.
      3. Preparare la soluzione al 40% mescolando 5 ml di PBS 10x, 0,05 ml di MgCl 1 M,₂, 0,125 ml di KCl 1 M e 33,3 ml di mezzo per gradiente di densità. Aggiustare il volume totale a 50 ml utilizzando H₂O.
      4. Preparare la soluzione al 60% mescolando 0,05 ml di MgCl 1 M₂, 0,125 ml di KCl 1 M, 50 ml di mezzo per gradiente di densità e 0,1 ml di Rosso Fenolo allo 0,5% (p/v).
   10. Con un ago e una siringa, caricare la soluzione del gradiente di iodixanolo nel tubo in polipropilene nell'ordine di 5 ml al 17%, 5 ml al 25%, 5 ml al 40% e 5 ml al 60%, partendo dal fondo. Caricare tutto il lisato ottenuto al passaggio 3.8 (14-16 ml) sulla sommità del gradiente. Il gradiente, elencato dal basso verso l'alto, è costituito dal 60%, 40%, 25%, 17% e dallo strato di lisato. Riempire il tubo con tampone di lisi e coprirlo con il tappo di sughero.
   11. Centrifugare a 185.000 x g per 90 min a 16 °C.
   12. Raccogliere la frazione virale (strato al 40%) con una siringa. Inserire l'ago (calibro 21) all'intersezione tra le frazioni al 40% e al 60%, aspirando esclusivamente lo strato al 40%.
       NOTA: Evitare l'aspirazione dello strato al 25%.
   13. Mescolare la frazione virale con soluzione sterile di poliossietilene-poliossipropilene copolimero in PBS (soluzione madre di poliossietilene-poliossipropilene copolimero al 10% diluita 1:10.000 in PBS) fino a un volume totale di 15 ml. Caricare la miscela nel tubo filtro (cutoff di peso molecolare = 100 kD). Centrifugare a 2.000 x g per 30 min a 4 °C.
   14. Scartare la soluzione presente nella parte inferiore. Riempire nuovamente il tubo filtrante con soluzione di PBS contenente poliossietilene-poliossipropilene copolimero a blocchi fino a un volume totale di 15 ml. Centrifugare a 2.000 x g per 20 min a 4 °CRipetere questo passaggio altre due volte. Raccogliere il virus rAAV9 purificato (la frazione sopra il filtro).
   15. Trasferire il rAAV9 purificato nel tubo filtro in tubi da 1,7 mL. Aliquotare il rAAV9 purificato (100 - 400 µl/tube, a seconda del volume e del titolo dell'AAV) e conservare il virus a -80 °C.
       NOTA: Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polietilenimina, lineare (PM 25.000)	Polysciences, Inc.	#23966-2
Tubo, polipropilene, 36,2 ml, 25 x 87 mm, (quantità 56)	Beckman Coulter, Inc	# 362183
Nucleasi, ultrapurificata	SIGMA	#E8263-25KU
Mezzo per gradiente di densità (Iodixanolo)	SIGMA	#D1556-250ML
Unità di filtrazione centrifuga con membrana Ultracel-100	EMD Millipore Corporation	#UFC910008
Ago da pipetta per laboratorio con estremità smussate a 90°, calibro 14, L 6 pollici, attacco nichelato	SIGMA	#CAD7942-12EA
Soluzione di Polossamero 188 (soluzione Pluronic® F-68)	SIGMA	P5556-100ML
Proteinasi K	SIGMA	3115828001
DNasi I	Roche	10104159001
Centrifuga	Thermo Scientific	75004260
Sistema di centrifugazione	Beckman Coulter	363118
Ultracentrifuga	Beckman Coulter
Mezzo DMEM	Fisher Scientific	SH30243FS
Siero bovino fetale	Atlanta Biologicals	S11150
Vettore rAAV9	Penn Vector Core	P1967