Immortalizzazione di cellule endoteliali tramite trasduzione retrovirale di oncogeni virali

Abstract

Fonte: McAllister, S. C., Hanson, R. S., et al. Un modello in vitro per lo studio della trasformazione cellulare da parte del virus dell'herpes del sarcoma di Kaposi. J. Vis. Exp.(2017)

Questo video dimostra la trasduzione retrovirale di cellule endoteliali primarie con gli oncogeni HPV16 E6/E7. Gli oncogeni integrati inattivano i soppressori tumorali p53 e Rb, prolungando la durata della vita cellulare. La selezione con G418 arricchisce le cellule trasdotte, producendo colture endoteliali immortalizzate adatte a studi di trasformazione.

Protocollo

Trasduzione delle cellule endoteliali (EC) con i geni del Papillomavirus E6 ed E7

NOTA: Utilizziamo abitualmente flaconi standard per colture cellulari per la crescita delle EC primarie. Tuttavia, se si ottiene una crescita insoddisfacente delle EC, si dovrebbe prendere in considerazione l'uso di flaconi per colture cellulari commerciali.

1. Coltivare cellule endoteliali primarie microvascolari o linfatiche dermiche umane in un incubatore umidificato a 37 °C più 5% CO₂₂ in mezzo di crescita per cellule endoteliali (EGM; contiene mezzo basale per cellule endoteliali [EBM] integrato con EGM-2 BulletKit [contenente siero bovino fetale, idrocortisone, fattore di crescita fibroblastico umano-B, fattore di crescita vascolare per cellule endoteliali, fattore di crescita simile all'insulina-1, acido ascorbico, fattore di crescita epidermico umano, antibiotici ed eparina]) in un fiasco da coltura cellulare T75 fino a una confluenza di circa il 50%.
2. Per la trasduzione, coltivare le cellule PA317 LXSN 16E6E7 in un incubatore umidificato a 37 °C con 5% di CO₂ in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con 10% di siero fetale bovino e agenti antimicrobici in un flacone per colture cellulari T150 fino a raggiungere una confluenza di circa il 90%. Incubare quindi in 16 mL di mezzo per tutta la notte. 37 °C più 5% CO₂₂ in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) integrato con siero bovino fetale al 10% e antimicrobici, in un flacone da coltura cellulare T150 fino a raggiungere una confluenza di circa il 90%. Incubare quindi per tutta la notte in 16 mL di mezzo.
3. Clarificare il mezzo PA317 centrifugando a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. × g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Rimuovere l'EGM dalla coltura di EC e sovrapporre le cellule con 12 mL di mezzo PA317 chiarificato, quindi incubare per 4 h.
   NOTA: Centrifugare 16 mL di mezzo condizionato a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente × g per 5 min genera un pellet compatto che non viene perturbato dalla successiva rimozione accurata di 12 mL di supernatante chiarificato. Tuttavia, se vi è il rischio di trasferimento delle cellule PA317 LXSN 16E6E7 nelle colture primarie di EC (la linea cellulare di confezionamento sopraffà rapidamente le EC), allora la filtrazione del supernatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può essere eseguita. 0.45 µm il filtraggio del surnatante condizionato attraverso un filtro da 0,45 µm prima del trasferimento può essere effettuato.
5. Sostituire 6 mL del mezzo PA317 con EGM fresco e incubare durante la notte.
6. Rinnovare il mezzo per le EC con 12 mL di EGM fresco e incubare ulteriormente per 48 h.
7. Per il sottocoltivo delle EC, rimuovere il mezzo e lavare con 12 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) priva di cationi, quindi aggiungere 3 mL di una soluzione enzimatica di dissociazione commerciale (ad es. TrypLE) e incubare a 37 °C per 3 min.
8. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. × g per 5 min a temperatura ambiente. Risospendere il pellet cellulare risultante in EGM fresco e dividere equamente in 3 × Flaconi T75 con un volume finale di 12 mL di EGM per flacone.
9. Per selezionare le EC trasdotte con E6 ed E7, aggiungere G418 a una concentrazione finale di 200 µg/mL per due passaggi, dopo i quali le EC trasdotte possono essere seminate per l'infezione o congelate in azoto liquido.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellule BCBL-1	NIH AIDS Reagent Program	3233
Cellule PA317	ATCC	CRL-2203
Cellule endoteliali microvascolari dermiche neonatali	Lonza	CC-2505
Mezzo Basale EBM-2	Lonza	CC-3156
Kit EGM-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
RPMI
DMEM
PBS con calcio e magnesio