Visualizzazione e valutazione delle dimensioni di Faustovirus mediante microscopia elettronica

Abstract

Fonte: Bou Khalil, J. Y., et al. Una strategia rapida per l'isolamento di nuovi Faustovirus da campioni ambientali utilizzando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016).

Questo video illustra l'analisi di particelle di faustovirus provenienti da una coltura di amebe infette mediante microscopia elettronica a trasmissione. Vengono descritti la preparazione della griglia, la colorazione negativa con molibdato di ammonio per migliorare il contrasto e la visualizzazione del virus al microscopio. Il protocollo si conclude con la misurazione delle dimensioni del faustovirus utilizzando gli strumenti software integrati del microscopio.

Protocollo

1. Microscopia elettronica
   1. Dopo l'identificazione iniziale sui vetrini, valutare la presenza del virus gigante mediante osservazione al microscopio elettronico dei coltivi in sovranatante.
   2. Deporre 5 µl del campione positivo su una griglia trattata al plasma. Attendere circa 20 minuti a temperatura ambiente.
   3. Asciugare con attenzione la griglia e deporvi una piccola goccia di molibdato di ammonio all'1% per 10 secondi. Lasciare asciugare la griglia per 5 minuti.
   4. Procedere con la microscopia elettronica a 200 keV.
   5. Posizionare la griglia sul portacampioni; inserire il portacampioni nel microscopio. Controllare l'anteprima del vuoto cliccando sull'icona corrispondente. Chiudere le valvole e iniziare l'osservazione con una spot size 5 e un'ingrandimento di x 25.000.
   6. Misurare il virus gigante utilizzando ImageJ oppure direttamente sul microscopio mediante lo strumento di misura presente nella schermata di acquisizione.
      NOTA: Classificare il campione nel gruppo Faustovirus con una dimensione del capside di circa 200 nm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stirpe di ameba CDC-19	ATCC	Francia	50237
Piastre	Cellstar	Francia	655180
Filtri a vuoto	Thermo scientific	Francia	BPV4550 / 20170115
Soluzione salina tamponata al fosfato	Thermo Fisher scientific	Francia	10010-023
Colorante DAPI	Life Technologies	Francia	D1306
Reticelle di carbonio	Euromedex	Francia	FCF400NI
Molibdato di ammonio	VWR internationanl	Francia	21276185
Flaconi	SARSTEDT	Germania	833911
Filtri 0,22 μm	Milex millipor	Francia	SE2M229104
Ultracentrifuga Sorval WX 80	Thermo scientific	Francia	9102448
Filtri a flusso rapido	Nalgene	Francia	450-0020