Determinazione della distribuzione dell'RNA virale nelle cellule ospiti mediante ibridazione in situ a fluorescenza

Abstract

Fonte: Vallery, T. K. & Steitz, J. A. Ibridazione fluorescente in situ quantitativa (FISH) e immunofluorescenza (IF) di prodotti genici specifici in cellule infette da KSHV. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video viene dimostrata l'ibridazione fluorescente in situ per visualizzare l'RNA virale in cellule infette da virus. Vengono illustrati i passaggi relativi all'ibridazione della sonda, all'amplificazione del segnale e all'analisi mediante microscopia confocale.

Protocollo

1. Fissazione, ibridazione e visualizzazione di RNA virali

1. Rimuovere il mezzo e le cellule in eccesso. Durante tutto il protocollo, utilizzare l'aspirazione sotto vuoto per rimuovere le soluzioni e micropipettare delicatamente per aggiungere le soluzioni.
   NOTA: La forza di un vuoto può essere ridotta posizionando un 200 µL punta di pipetta microlitrica sopra la pipetta di vetro di Pasteur. Sostituire la punta di pipetta microlitrica tra un passaggio di lavaggio e l'altro per prevenire contaminazioni. Ogni passaggio di lavaggio deve essere eseguito rapidamente perché è fondamentale che le cellule non si secchino mai.
2. Immediatamente, fissare le cellule con formaldeide al 4% pre-raffreddata in PBS (soluzione salina tamponata al fosfato) sul ghiaccio per 30 min. Lavare le cellule tre volte con 200 µL 1x PBS raffreddato a 4 °C e incubare per 5 min a temperatura ambiente o sul ghiaccio.
   1. Permeabilizzare le cellule fissate con 200 µL di 0,5% di Triton-X/PBS pre-raffreddato per 10 minuti sul ghiaccio oppure 750 µL di etanolo al 70% pre-raffreddato a 4 °C da 1 h (min) a 7 d (max)
      NOTA: Tutti i lavaggi descritti in questo protocollo vengono eseguiti nello stesso modo, salvo diversa indicazione. L'etanolo al 70% ammorbidisce la colla tra le camere e il vetrino, facilitando la successiva separazione, e introduce anche una pausa significativa nel protocollo. Tuttavia, utilizzare una pellicola di paraffina intorno al vetrino con camere per ridurre l'evaporazione e controllare il livello dell'etanolo in ciascuna camera ogni circa 8 ore. L'etanolo al 70% appiattisce inoltre le cellule, producendo un'immagine più nitida, mentre Triton-X non disidrata le cellule né ne altera le dimensioni.
3. Rimuovere con attenzione le camere per evitare di crepare il vetrino.
   NOTA: Utilizzare un dispositivo di rimozione nuovo o uno con residui minimi di adesivo fornito dal produttore, staccando delicatamente le camere per evitare che il vetrino si incrinino. L'uso di etanolo al 70% come reagente permeabilizzante per 4 h riduce notevolmente la probabilità di incrinature. In caso di incrinatura, proseguire il protocollo sulle camere non interessate dalla fessura e prestare attenzione al maggiore tasso di ossidazione dei vetrini imperfettamente sigillati (ovvero, vita di conservazione ridotta).
4. Lavare le cellule una volta con SSC 2x (citrato di sodio salino) e quindi applicare 45 µL di soluzione di ibridazione composta da 50% di formammide, 10% di dextrano solfato, 2x SSC, 0,1% di albumina sierica bovina (BSA), 500 µg/mL acido desossiribonucleico (DNA) di sperma di salmone, 125 µg/mL E. coli acido ribonucleico di trasferimento (tRNA) e complessi di ribonucleoside vanadilici 1 mM. Incubare per 1 h a 37 °C in una camera umidificata che può essere una piastra di Petri da 150 mm con salviette sterili inumidite.
   NOTA: Preparare una soluzione di ibridazione fresca almeno un'ora prima dell'uso. Sciogliere prima il solfato di destrano in acqua, vorticosando frequentemente e incubando in un 37 °C bagno termostatato
5. Calcolare la quantità di oligonucleotidi necessaria per raggiungere la concentrazione suggerita di 25 µM in 35 µL di soluzione di ibridazione per ogni camera. Regolare la concentrazione dell'oligonucleotide antisenso secondo necessità. Aggiungere acqua distillata agli oligonucleotidi per portare il volume di denaturazione a 10 µL.
   NOTA: Dopo la reazione di marcatura, gli oligonucleotidi vengono conservati nella soluzione tamponata contenente 0,18 M di cacodilato di potassio, 23 mM di Tris-HCl, 0,23 mg/mL di BSA, 4,5 mM di CoCl₂, 18 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 2,7 mM di fosfato di potassio e 6,8 mM di KCl, 45 µM 2-mercaptoetanolo, 0,02% Triton X-100 e 2% glicerolo. Le concentrazioni sono sufficientemente elevate perché la diluizione con acqua porti la soluzione di denaturazione a concentrazioni prossime a 1x TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA), un buffer standard per la denaturazione di oligonucleotidi.
6. Denaturare gli oligonucleotidi marcati con digossigenina (DIG) e/o Alexa Fluor 594 a 95 °C per 5 min. Quindi aggiungere 35 µL soluzione di ibridazione fresca per ogni camera prevista sugli oligonucleotidi denaturati. Se si esegue un'ibridazione fluorescente in situ (FISH) doppia, entrambi i set di oligonucleotidi antisenso possono essere denaturati e ibridati contemporaneamente.
7. Rimuovere la soluzione di pre-ibridazione, quindi aggiungere la soluzione di ibridazione contenente gli oligonucleotidi marcati alle cellule. Incubare per tutta la notte nella camera umidificata a 37 °C con foglio di alluminio per proteggere gli oligonucleotidi marcati con fluoroforo.
   NOTA: L'incubazione deve durare almeno 10 h e non più di 24 h.
8. Il giorno successivo, lavare le cellule due volte con 2x SSC per 10 min a 37 °C e poi due volte con SSC 1x per 10 minuti a 25 °C.
9. Fissare le cellule con formaldeide al 4% in PBS 1x pre-raffreddata per 10-15 minuti sul ghiaccio. Lavare quindi le cellule con PBS per tre volte e permeabilizzare per 1 ora con etanolo al 70% pre-raffreddato oppure per 10 minuti con Triton-X al 0,5% in PBS 1x pre-raffreddato a 4 °C.
10. Incubare le cellule con anti-digossigenina (DIG)–fluoresceina isotiocianato (FITC) 1:200 in BSA 0,1% / PBS 1x pre-raffreddato per 1 h a 4 °C. Rimuovere la soluzione di anticorpi e lavare tre volte con PBS 1x.
11. Fissare con formaldeide al 4% pre-raffreddata in PBS 1x per 10-15 min a 4 °C e quindi lavare tre volte con PBS 1x.
12. Incubare le cellule con 0.4 µg/mL 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in Triton-X 0,5% pre-raffreddato in PBS 1x per 15 minuti sul ghiaccio, quindi lavare tre volte con PBS 1x.
13. Montare i vetrini con perline fluorescenti (opzionale) e un mezzo di montaggio. Quindi sigillare il coprioggetto al vetrino con smalto trasparente.
14. Utilizzando un microscopio confocale, acquisire le immagini dei campioni entro un'ora e una settimana dall'esecuzione del protocollo a un ingrandimento di 630x. Applicare più strati di smalto per unghie per sigillare il vetrino coprioggetto e prolungare la durata dei fluorocromi riducendo il tasso di ossidazione.
    NOTA: Non utilizzare un mezzo di montaggio contenente DAPI. Durante l'acquisizione delle immagini, includere la barra della scala in ciascuna immagine per una successiva quantificazione. Le perle fluorescenti fungono da controllo dell'intensità di fluorescenza tra diversi vetrini e preparazioni del campione. Acquisire le immagini nella sezione mediana della cellula per una quantificazione bidimensionale (2D).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anti-DIG FITC	Jackson Lab Immunologicals	200-092-156
Solfato di destrano	Sigma Aldrich	D8906	Grado per biologia molecolare
Kit per marcatura con oligonucleotidi DIG	Sigma Roche	#03353583910	2ª generazione
Vetrini a otto camere	Nunc Lab Tek II	#154453	Il sigillo blu favorisce la tensione superficiale, ma è disponibile anche la separazione mediante gel trasparente.
Formammide	Sigma Aldrich	F9037	Grado per biologia molecolare
Complessi di ribonucleosidi vanadilici	NEB	S1402S