Misurazione dell'induzione spontanea dei fagi nei batteri lisogeni nel tempo

Abstract

Fonte: Krishnamurthi, R., et al. Comprensione dell'Impatto dei Bacteriofagi Temperati sui Loro Lisogeni tramite Trascrittomica. J. Vis. Exp. (2024).

Questo video illustra l'enumerazione temporale dell'induzione spontanea di fagi in Pseudomonas aeruginosa lisogenica, quantificando nel tempo le cellule batteriche vitali (UFC) e le particelle fagiche infettive (UPF). Campionando a intervalli definiti durante la crescita e analizzando sia la formazione di colonie che quella di placche, il metodo rivela il momento in cui l'induzione spontanea è minima. Ciò consente di identificare i punti temporali ottimali per analisi trascrittomiche successive, con interferenza litica minima.

Protocollo

1. Enumerazione diretta temporale dell'induzione spontanea (Figura 1)

1. Preparare colture di partenza notturne sia del lisogeno (ad esempio, lisogeno di P. aeruginosa PAO1 che ospita fagi LES (Liverpool Epidemic Strain (LES) batteriofagi)) che dell'ospite indicatore (PAO1-RifR) inocularando una singola colonia in 5 mL di brodo LB (Luria–Bertani), e incubare a 37 °C con agitazione a 180 giri/min (18–24 h).^R(resistente alla rifampicina) Pseudomonas aeruginosa PAO1) inoculando una singola colonia in 5 mL di LB (brodo Luria-Bertani) e incubando a 37 °C con agitazione a 180 giri/min (18–24 h).
2. Preparare colture fresche di lisogeno e di ceppo indicatore inocularando le colture da incubato in 100 mL di LB in rapporto 1:100 e incubare a 37 °C con agitazione (180 giri/min).
   1. Monitorare la crescita del lisogeno misurando l'OD₆₀₀ e conteggio della vitalità mediante la tecnica di Miles Misra. Per fare ciò, prelevare un campione di 1 mL da ciascuna coltura di lisogeno ogni ora a partire dal momento dell'inoculo per 8 h.
   2. Diluire in serie il campione immediatamente dopo il prelievo aggiungendo 100 µL del campione in 900 µL del rispettivo mezzo. Vortexare accuratamente alla velocità massima, scartare la punta ad ogni diluizione e proseguire la serie di diluizioni da 10⁻¹ a 10⁻⁹.
   3. Puntare 10 µL delle diluizioni richieste in triplice replicazione su una piastra di agar LB, lasciare asciugare e incubare a 37 °C per 18–24 h.

   4. Per calcolare il numero di cellule batteriche vitali, individuare un'assunzione con colonie facilmente contabili. Contare il numero di colonie in ciascun spot e quindi utilizzare la seguente formula:
       

      

      
      NOTA: Durante la crescita della coltura lisogena, verranno prodotte particelle fagiche attive mediante induzione spontanea. La produzione di fagi infettivi implica che il trascrittoma della popolazione lisogena risulti ormai contaminato dall'espressione genica associata al ciclo replicativo litico, derivante dal segnale di replicazione del fago litico e dalla corrispondente risposta della cellula ospite. È quindi fondamentale identificare la fase di crescita in cui il rapporto tra cellule lisogeniche e particelle fagiche infettive libere è massimo, al fine di ridurre il più possibile il rumore di fondo nella trascrizione (generato dal trascrittoma del fago litico) nel set di dati.

3. Per enumerare le particelle fagiche infettive in ogni campione temporale, inoculare 5 mL di agar batteriologico sterile allo 0,4% in LB (agar superiore) con 100 µL di colture indicatrici in fase esponenziale media (OD600: 0,4–0,5; in questo caso, PAO1-Rif^Rin presenza di un opportuno agente selettivo (50 µg·mL⁻¹ rifampicin in questo caso, poiché la CMI dell'ospite PAO1 è soltanto 16 µg·mL⁻¹)
   1. Piastrare 10 µL della stessa diluizione seriale (vedi punto 1.2.2) sullo strato di agar superiore inoculato, e lasciare asciugare prima di incubare a 37 °C per 18–24 h.

   2. Per calcolare il numero di particelle fagiche infettive, individuare un diluizione con placche facilmente contabili. Contare il numero di placche in ciascun spot.
       

      

   3. Individuare il tempo/condizione per cui l'induzione spontanea per UFC (unità formante colonie) è minima ai fini dei successivi passaggi sperimentali.

Risultati

Figura 1: La progettazione sperimentale per la conta di PFU e CFU di un lisogeno a partire dallo stesso campione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PAO1		6
LESB58		6
Batteriofagi LES	Indotti e purificati da LESB58 utilizzando Norfloxacina.
Brodo Lysogeny (LB)	Merck	1.10285.500
Agar LB	Merck	1.10283.500
Agar Agar	Fisher	A/1080/53
Agar superiore	0,4 g di Agar Agar + 2,5 g di Brodo LB in 100 mL di acqua; autoclavare e utilizzare.	-
Rifampicina	Sigma (Soluzione madre: 50 mg/mL in metanolo - Mescolare bene e sterilizzare con filtro 0,22 µm, conservare a -20 °C fino all'uso)	R3501