Questo video dimostra l'induzione della replicazione litica in un profago integrato nel genoma batterico e il rilevamento delle variazioni nell'espressione genica mediante campionamento temporizzato per l'analisi trascrittomica.
Articolo metodologico
Induzione della replicazione litica del profago per l'analisi trascrittomica
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Preparazione di colture di lisogeni non indotte e indotte per l'estrazione di RNA (acido ribonucleico)
- Allestire una coltura fresca notturna inoculando una singola colonia del lisogeno in 5 mL di LB, e incubare a 37 °C con agitazione (180 rpm (giri al minuto)) per 18–24 h.
- Subcolturare la coltura notturna in 80 mL di LB (brodo lisogenico) in rapporto 1:100 in otto fiasche da 250 mL.
- Etichettare la prima fiasca come “non indotta” e le altre come “indotte”, indicando anche i punti temporali in cui ciascun campione deve essere raccolto (ad es., “indotta t = 0”, “indotta t = 10 min”, “indotta t = 20 min”, ecc.; (Figura 1).
- Dopo 90 min di incubazione, quando la DO (densità ottica) a 600 nm è compresa tra 0,1 e 0,2, o al momento della minima induzione spontanea (vedere la discussione), aggiungere 4 µL di acido acetico glaciale al 1% (v/v) alla fiasca non indotta (Figura 1).
NOTA: Poiché l'agente induttore in questo studio è stato preparato utilizzando acido acetico glaciale al 1% come solvente, la stessa quantità di solvente è stata aggiunta da sola come controllo. Possono essere considerati controlli alternativi a seconda della preparazione di diversi induttori. - Aggiungere la coltura da 80 mL della fiasca non indotta a 720 mL di LB sterile, e immediatamente aggiungere la soluzione di arresto (fenolo al 5% [v/v] freddo in ghiaccio, pH 4,3, etanolo al 95% [v/v]) in un volume pari al 20% del volume della coltura (160 mL), quindi incubare sul ghiaccio per un minimo di 30 min e non più di 2 h per stabilizzare i trascritti di RNA. Questo è il campione non indotto.
- Indurre le colture rimanenti in sette fiasche da 250 mL (Figura 1) con la CMI finale (concentrazione minima inibitoria finale) di un opportuno agente induttore (in questo caso, norfloxacina 25 mg·mL−1, preparata in acido acetico glaciale al 1% [p/v], utilizzata a una concentrazione finale di 1 µg·mL−1), mescolare bene e incubare a 37 °C con agitazione a 180 rpm per 1 h.
NOTA: Questo passaggio forzerà la coltura lisogenica in uno stato più coordinato di replicazione litica. La maggior parte delle cellule della coltura inizierà la produzione litica di particelle fagiche infettive. - Permettere alle cellule di recuperare aggiungendo 80 mL di coltura dalla fiasca indotta a 720 mL di LB sterile, diluendo efficacemente l'agente induttore. Raccogliere le cellule batteriche da ciascuna fiasca ogni 10 min dal tempo 0 fino a 1 h aggiungendo la soluzione di arresto, come indicato nel passaggio 1.5.
NOTA: La soluzione di arresto stabilizza l'RNA fino a 2 h. Tuttavia, per migliorare la stabilità del campione, eseguire tutti i passaggi successivi a 4 °C. - Raccogliere per centrifugazione a 10.000 x g per 15 min a 4 °C il più presto possibile, senza superare le 2 h dal trattamento per evitare la degradazione dell'RNA.
- Eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente i pellet batterici nel liquido residuo utilizzando una pipetta automatica regolabile prima di trasferire ciascun campione in una provetta microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare le provette microcentrifughe ad alta velocità (13.000 x g) in un microcentrifugatore a 4 °C per 1 min e scartare il soprannatante residuo.
- Congelare rapidamente i pellet immergendo ciascuna provetta microcentrifuga sigillata in azoto liquido. Questo favorirà una lisi cellulare efficiente per l'estrazione dell'RNA.
- Aggiungere TRIzol (1 mL) a ciascun pellet congelato e omogeneizzare la sospensione per pipettaggio (non vortexare). Conservare a −80 °C fino al momento dell'estrazione dell'RNA per tutti i campioni.
NOTA: Il protocollo può essere interrotto in questo punto. - Ripetere i passaggi da 1.1 a 1.13 con tre replicati biologici.
Risultati
Figura 1: Il disegno sperimentale per il campionamento di colture indotte e non indotte per l'isolamento dell'RNA.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Batteriofagi LES | Indotto e purificato da LESB58 utilizzando norfloxacina. | Questo studio | |
| Brodo lisogenico (LB) | Merck | 1.10285.500 | |
| Agar LB (Lysogeny Broth) | Merck | 1.10283.500 | |
| Agar Agar | Fisher | A/1080/53 | |
| Agar superiore | 0,4 g di Agar Agar + 2,5 g di LB Broth in 100 mL di acqua; autoclavare e utilizzare. | - | |
| Rifampicina | Sigma (Stock: 50 mg/mL in metanolo - Mescolare bene e utilizzare 0.22µm filtrare per sterilizzare e conservarlo in -20°C fino all'uso | R3501 | |
| Acido acetico glaciale | Fisher 1% (v/v) in acqua | 10060000 | |
| Norfloxacina | Sigma (Stock: 25 mg/mL di acido acetico glaciale al 1%) - Mescolare bene e utilizzare 0.22µm filtrare per sterilizzare e conservarlo in -20°C fino all'uso; per evitare cicli di congelamento e scongelamento, conservare in piccole aliquote | N9890 | |
| Fenolo satura con tampone citrato pH 4,3 | Sigma | P-4682 | |
| Etanolo di grado biologia molecolare | Fisher | 16695992 | |
| TRIzol | Invitrogen | 12044977 | |
| Cloroformio | Fisher | 11398187 | |
| Isopropanolo | Fisher | 17150576 | |
| Acqua priva di nucleasi | Invitrogen | 10526945 |
