Raccolta del virus adeno-associato da cellule di mammifero trasfettate

Abstract

Fonte: Rghei, A. D., et al. Produzione di Vettori Virali Adeno-Associati in Pile Cellulari per Studi Preclinici in Modelli Animali di Grande Taglia. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video illustra il recupero del virus adeno-associato grezzo da cellule mammifere trasfettate mediante lisi chimica e centrifugazione, consentendo una produzione ad alto rendimento di AAV per applicazioni di purificazione successiva e di terapia genica preclinica.

Protocollo

1. Raccolta dell'AAV (virus adeno-associato) e lisi chimica delle cellule HEK293 (cellule renali embrionali umane 293) transfezionate

1. Agitare vigorosamente la camera di coltura cellulare per staccare le cellule finché il mezzo non appare torbido a causa delle cellule staccate e versare in quattro provette da centrifuga da 500 mL.
2. Centrifugare le provette a 18.000 x g per 30 min a 4 °C per formare il pellet cellulare. Versare il soprannatante chiarificato in una bottiglia da 1 L in copoliestere di tereftalato di polietilene (PETG).NOTA: Se non si dispone di una centrifuga ad alta velocità, centrifugare a 12.000 x g per 40 min. A questa velocità, il pellet cellulare potrebbe non essere solido e potrebbe scivolare durante la rimozione del soprannatante.
3. Risospendere i pellet cellulari in provette da centrifuga da 500 mL con 50 mL di tampone di lisi e incubare per 60 min a 37 °C.
4. Centrifugare le provette a 18.000 x g per 30 min, quindi trasferire il soprannatante nella stessa bottiglia da 1 L in PETG. Scartare i detriti cellulari pelletizzati.NOTA: Purificare immediatamente il soprannatante chiarificato e conservarlo a 4 °C per un massimo di 72 h. Per una conservazione a lungo termine, conservare a -80 °C. Non conservare a -20 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellstack da 10 camere	Corning	3271
Bottiglia da 1 L in PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) con D-glucosio 1000 mg/L, L-glutammina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Cellule HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	All'arrivo, scongelare le cellule e coltivarle come descritto nel protocollo del produttore. Una volta che le cellule sono state sottoposte a un numero minimo di passaggi e crescono regolarmente, congelarne una frazione in aliquote e conservarle in azoto liquido. Utilizzare sempre cellule con numero di passaggi inferiore a 30. Quando le cellule coltivate sono state sottoposte a più di 30 passaggi, si raccomanda di riavviare la coltura a partire dalle aliquote conservate
Cuscinetto di supporto per provette centrifuga ad alto volume	Corning	CLS431124	Il cuscinetto di supporto deve essere utilizzato con provette centrifuga ad alto volume a meno che il rotore della centrifuga non disponga di cuscinetti appositi a fondo conico (V-bottom)
Provette centrifuga ad alto volume	Corning	CLS431123-6EA	Provette centrifuga da 500 mL