Purificazione di vettori di virus adeno-associati mediante cromatografia di affinità

Abstract

Fonte: Rghei, A. D., et al. Produzione di vettori virali adeno-associati in coltura su stack cellulari per studi preclinici in modelli animali di grandi dimensioni. J. Vis. Exp. (2021)

Il video dimostra la purificazione di vettori virali adeno-associati ricombinanti (AAV) da un lisato grezzo dell'ospite mediante una matrice di affinità a base di eparina. Le particelle virali si legano all'eparina immobilizzata, mentre le impurità vengono rimosse con lavaggi. Un tampone ad alto contenuto salino rilascia i virus integri, che vengono raccolti in frazioni arricchite. Queste frazioni vengono concentrate mediante centrifugazione su membrana e sottoposte a risciacquo per recuperare le particelle residue, ottenendo vettori AAV purificati ad alto titolo.

Protocollo

1. Trasfezione con doppio plasmide di cellule HEK293 in stack cellulari

1. Scongelare una provetta criogenica di cellule di rene embrionale umano 293 (HEK293) in un bagno a sferette impostato a 37 °C.
   NOTA: Riscaldare preventivamente il terreno completo di Dulbecco (DMEM) modificato a 37 °C durante lo scongelamento delle cellule per evitare lo shock da freddo durante la semina. Assicurarsi che le cellule abbiano un numero di passaggi basso, idealmente inferiore a 20, per garantire un’ottimale crescita e efficienza di trasfezione. Assicurarsi che le cellule siano certificate come libere da micoplasma.
2. Trasferire il contenuto della provetta criogenica goccia a goccia in un tubo conico da 15 mL contenente 10 mL di DMEM completo pre-riscaldato e centrifugare le cellule a 500 × g per 5 min.
3. Aspirare il terreno e quindi risospendere le cellule HEK293 in 20 mL di DMEM completo pre-riscaldato. Seminare le cellule in una piastra da 15 cm e incubare a 37 °C, con 5% di CO₂.
4. Dividere le cellule da una piastra da 15 cm in tre per la semina nella camera di coltura cellulare.
   1. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell’80%, aspirare il terreno e lavare delicatamente la piastra con 3 mL di soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) per non alterare il monococco. Quindi, aspirare il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina.
   2. Incubare per 2 min a 37 °C finché le cellule non si staccano dalla piastra, quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo 7 mL di DMEM completo alla piastra.
   3. Raccogliere tutto il terreno e le cellule in un tubo da 15 mL e pellettizzare le cellule centrifugando a 500 × g per 5 min.
   4. Aspirare il soprannatante dal tubo da 15 mL e risospendere il pellet cellulare in 3 mL di DMEM completo. Aggiungere 1 mL in ciascuna piastra da 15 cm contenente 20 mL di DMEM completo; agitare delicatamente le piastre per distribuire uniformemente le cellule e incubare a 37 °C, con 5% di CO₂.
5. Quando le cellule raggiungono una confluenza dell’80%, ripetere i passaggi 1.4.1 e 1.4.2. Raccogliere il soprannatante in tubi conici da 50 mL e capovolgere delicatamente il tubo per assicurare un’omogeneità cellulare.
6. Determinare la densità cellulare mescolando 10 µL del campione cellulare con 10 µL di blu di tripano e aggiungendo la miscela su un vetrino per conteggio cellulare da analizzare nel contatore cellulare.
7. Mescolare 1 L di DMEM completo pre-riscaldato con la sospensione cellulare necessaria per seminare la camera di coltura cellulare (superficie di 6360 cm²) con 1 × 10⁴ cellule/cm². Versare la miscela cellulare nella camera di coltura cellulare e ruotare delicatamente per distribuire uniformemente le cellule su ciascun monococco (Figura 1) e incubare a 37 °C, con 5% di CO₂.
8. Oltre alla camera di coltura cellulare, seminare una piastra da 15 cm con 1 × 10⁴ cellule/cm² come riferimento per la confluenza.
9. Dopo un’incubazione di circa 65 ore, verificare la confluenza sulla piastra di riferimento, idealmente tra l’80% e il 90%.
   NOTA: Riscaldare preventivamente il DMEM completo da aggiungere alla camera di coltura cellulare a 37 °C.
10. Preparare una miscela di polietilenimina (PEI)/DNA in un rapporto di concentrazione 3:1 (p/p).
    1. Preparare la miscela di DNA in un tubo conico da 50 mL aggiungendo 475 µg di pTrangene e 1425 µg di pHelper a 40 mL di mezzo con siero ridotto per ottenere un rapporto 3:1 di pHelper:pTrangene.
       NOTA: Il calcolatore per la miscela PEI/DNA è disponibile in Tabella 1.

Trasfezione della camera di coltura cellulare
Protocollo
1. Portare DNA, OptiMEM e PEI a temperatura ambiente prima della trasfezione
2. Inserire il numero di pile di colture cellulari da trasfettare (non è necessario aggiungere un eccesso)
3. Verificare che le concentrazioni del DNA siano corrette, poiché ciò influirà sui volumi richiesti
Numero di camere di coltura cellulare		1
Concentrazione del plasmide del transgene		1	mg/mL
Concentrazione del plasmide pDGM6.2FF		1	mg/mL
		Quantità per camera di coltura cellulare		Mastermix per trasfezione
	OptiMEM	48.1	mL	48.1	mL
Rapporto 1:3 pTransgene:pHelper	pTransgene	475	µg	475	µL
	pHelper	1425	µg	1425	µL
4. Aggiungere i volumi richiesti di OptiMEM e DNA plasmidico in un tubo conico da 50 mL
5. Capovolgere il tubo 10 volte per mescolare
Rapporto 3:1 PEI:DNA	PEI Max	5.7	mL	5.7	mL
6. Aggiungere la quantità richiesta di PEI al tubo da 50 mL contenente OptiMEM e DNA plasmidico
7. Chiudere immediatamente il tubo da 50 mL e agitare con il vortex e capovolgere 3–5 volte per mescolare.
8. Impostare un timer per 10 min per consentire l'incubazione dei complessi PEI
9. Trasferire le pile di colture cellulari da trasfettare all'interno della cappa a sicurezza biologica (BSC)
10. Dopo 10 min, versare il mix di trasfezione in una porta arancione.
11. Mescolare delicatamente il liquido in tutta la pila cellulare
12. Riportare la pila di cellule trasfettate nell'incubatore assicurandosi un volume uguale su ogni strato
13. Raccogliere la camera di coltura cellulare 72 h dopo

Tabella 1: Calcolatore della trasfezione per camera di coltura cellulare. Foglio di lavoro interattivo per determinare la corretta concentrazione di pTransgene, pHelper e PEI per la trasfezione della camera di coltura cellulare.

2. Aggiungere 5,7 mL di PEI (1 g/L) al mezzo con siero ridotto e alla miscela di DNA in modo goccia a goccia. Quindi, vortexare brevemente e incubare per 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Durante l'incubazione di PEI/DNA a temperatura ambiente, la soluzione diventerà leggermente torbida.

11. Dopo 8 min di incubazione con PEI/DNA, rimuovere il mezzo dal compartimento di coltura cellulare.
    NOTA: Assicurarsi di allentare entrambi i tappi arancioni per mantenere un flusso regolare del mezzo, evitando il distacco delle cellule.
12. Aggiungere il complesso PEI/DNA a 1 L di DMEM completo preriscaldato e versare lentamente la miscela nell'ingresso del compartimento di coltura cellulare. Distribuire il liquido uniformemente in tutte le file (Figura 1) e incubare per 72 h a 37 °C, con 5% CO₂.

2 Raccolta del virus adeno-associato (AAV) e lisi chimica delle cellule HEK293 transfezionate

1. Agitare vigorosamente la camera di coltura cellulare per staccare le cellule finché il mezzo non appare torbido a causa delle cellule staccate, quindi versare il contenuto in quattro provette da centrifuga da 500 mL.
2. Centrifugare le provette a 18.000 × g per 30 min a 4 °C per ottenere il pellet cellulare. Versare il soprannatante chiarificato in una bottiglia da 1 L in copoliestere di tereftalato di polietilene (PETG).
   NOTA: Se non si dispone di una centrifuga ad alta velocità, centrifugare a 12.000 × g per 40 min. A questa velocità, il pellet cellulare potrebbe non essere compatto e potrebbe scivolare durante lo svuotamento del soprannatante.
3. Risospendere i pellet cellulari nelle provette da 500 mL con 50 mL di tampone di lisi e incubare per 60 min a 37 °C.
4. Centrifugare le provette a 18.000 × g per 30 min, quindi trasferire il soprannatante nella stessa bottiglia da 1 L in PETG. Scartare i detriti cellulari pelletizzati.
   NOTA: Purificare immediatamente il soprannatante chiarificato e conservarlo a 4 °C per un massimo di 72 h. Per una conservazione a lungo termine, conservare a -80 °C. Non conservare a -20 °C.

3 Purificazione del vettore AAV mediante cromatografia di affinità con eparina

1. Rimuovere il lisato grezzo da -80 °C e lasciarlo scongelare a 4 °C durante la notte. Una volta scongelato, filtrare il lisato grezzo utilizzando un filtro da 0,22 µM.
2. Per passivare il concentratore centrifugo, aggiungere 4 mL di tampone per il pretrattamento del filtro a un concentratore centrifugo per ogni colonna di sepharosio eparinico utilizzata. Passivare il concentratore centrifugo a temperatura ambiente per 2-8 h. Impostare la passivazione immediatamente prima dei passaggi di purificazione.
3. Preparare i tubi e la pompa (Figura 2).
   1. Collocare i tubi in una pompa peristaltica ed eseguire 20 mL di NaOH 1 M. Successivamente, eseguire 50 mL di acqua di grado molecolare e quindi 50 mL di DMEM basale.
   2. Collegare la colonna di sepharosio eparinico da 5 mL ai tubi ed eseguire 25 mL di DMEM basale per rimuovere il conservante.
4. Fare passare 0,2 µM del lisato grezzo filtrato attraverso la colonna a un flusso di 1-2 gocce/s.

NOTA: Fare attenzione a non introdurre bolle o far asciugare la colonna, poiché ciò comprometterebbe la colonna stessa e impedirebbe l'eluzione dell'AAV. Scartare la colonna se si asciuga e utilizzarne una nuova per il resto del lisato grezzo.

5. Caricare tutto il lisato grezzo sulla colonna a eparina e utilizzare le seguenti soluzioni per lavare la colonna.
   1. Lavare utilizzando 50 mL di 1× Soluzioni saline equilibrate di Hank (HBSS) senza Mg²⁺ e Ca²⁺.
   2. Lavare utilizzando 15 mL di N-Lauroilsarcosina allo 0,5 % in HBSS senza Mg²⁺ e Ca²⁺.
   3. Lavare con 50 mL di HBSS senza Mg²⁺ e Ca²⁺.
   4. Lavare con 50 mL di HBSS con Mg²⁺ e Ca²⁺
   5. Lavare con 50 mL di NaCl/HBSS 200 mM con Mg²⁺ e Ca²⁺.
   6. Eluire 5 × 5 mL (25 mL in totale) con NaCl/HBSS 300 mM con Mg²⁺ e Ca²⁺ e etichettare le eluizioni come E1-E5 (ciascuna eluizione è di 5 mL).
6. Concentrazione del virus mediante concentratore centrifugo
   1. Far ruotare il concentratore centrifugo contenente il tampone di pre-trattamento a 900 × g per 2 min. Eliminare il flusso passante.
   2. Lavare il filtro del concentratore centrifugo con 4 mL di HBSS con Mg²⁺ e Ca²⁺ e centrifugare a 1000 × g per 2 min; scartare il flusso passante.
   3. Aggiungere l'eluato E2 al concentratore centrifugo. Centrifugare a 1000 × g per 5 min e scartare il flusso passante.
   4. Terminare l'aggiunta di E2 e quindi aggiungere E3 al concentratore centrifugo ed eseguire la centrifugazione a 1000 × g per 5 min fino a quando il virus concentrato è di circa 1 mL.
      NOTA: Evitare di centrifugare il vettore fino a ridurre il volume al di sotto del livello del filtro. Non concentrare E1, E4 o E5 nel concentratore centrifugo, poiché contengono una quantità trascurabile o nulla di vettore e presentano contaminanti.
   5. Rimuovere il virus concentrato dal concentratore centrifugo utilizzando una punta filtrata p200 e trasferirlo in una provetta sterile da 1,5 mL.
   6. Risciacquare il concentratore centrifugo con 200 µL di HBSS con Mg²⁺ e Ca²⁺ per rimuovere qualsiasi AAV residuo dal filtro. Pipettare su e giù vigorosamente più volte (per circa 30 s) per staccare qualsiasi virus aderito alla membrana e trasferire il tutto nel tubo centrifuga da 1,5 mL contenente il resto del virus. Mescolare accuratamente il tubo.
   7. Aliquota 5 µL per l'estrazione del DNA e conservare il vettore purificato a -80 °C.
7. Lavare la colonna utilizzando 25 mL di NaCl 2 M. Successivamente, utilizzare 25 mL di Triton X-100 0,1%, preriscaldato a 37 °C per lavare la colonna. Successivamente, lavare la colonna utilizzando 50 mL di dH sterile₂O, quindi lavare con 25 mL di etanolo al 20%.
8. Assicurarsi che la membrana della colonna sia completamente saturata in etanolo al 20%, poiché questa è la soluzione di conservazione. Sigillare la colonna con i tappi forniti e conservare a 4 °C.
9. Conservare il tubo in NaOH 1 M.
   NOTA: Se puliti correttamente, le colonne di sepharosio eparinico possono essere riutilizzate fino a cinque volte.

Risultati

Figura 1: Movimentazione dello stack cellulare per la semina e la trasfezione delle cellule. Per la semina dello stack cellulare, iniziare rimuovendo uno dei tappi di ventilazione e versando 1 L di terreno completo di Dulbecco modificato (DMEM) preriscaldato con la quantità necessaria di cellule HEK293 (A). Distribuire uniformemente le cellule e il terreno stringendo entrambi i tappi di ventilazione, quindi raccogliere tutto il terreno nell'angolo dello stack cellulare con uno dei tappi e posizionarlo in quell'angolo (B), appoggiare lo stack cellulare su un lato (C) e ruotarlo poi di 90° (D) in modo che i porti di ventilazione siano rivolti verso l'alto (E). Abbassare delicatamente lo stack cellulare nella sua posizione orizzontale normale e verificare che tutte le camere dello stack siano completamente ricoperte di terreno (F). Durante la trasfezione, svitare entrambi i tappi di ventilazione e versare lentamente il vecchio terreno in un contenitore sterile per rifiuti, facendo attenzione a un flusso uniforme per non disturbare il monolayer cellulare (G).

Figura 2: Configurazione della pompa peristaltica per la purificazione del virus adeno-associato (AAV). Collegare il tubo dal lisato grezzo, attraverso la pompa peristaltica, fino alla colonna con matrice di eparina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro da 0,22 μm	Millipore Sigma	S2GPU05RE
Tripsina allo 0,25%	Fisher Scientific	SM2001C
Stack cellulare da 10 camere	Corning	3271
Flacone da 1 L in PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000
Piastre per colture cellulari	Greiner bio-one	7000232	Piastre da 15 cm
Provette coniche per colture	Thermo Fisher Scientific	339650	Provetta conica da 15 mL
Provette coniche per colture	Fisher Scientific	14955240	Provetta conica da 50 mL
Mezzo di coltura Dulbecco modificato (DMEM) con D-glucosio 1000 mg/L, L-glutammina	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Etilene	Greenfield	P016EA95	Diluire l’alcol etilico (95% vol) al 20% per la sezione 3.7.4
Suero bovino fetale (FBS)	Thermo Fisher Scientific	SH30396.03
Soluzioni saline equilibrate di Hank (HBSS) con Mg²⁺ e Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH302268.02
Soluzioni saline equilibrate di Hank (HBSS) senza Mg²⁺ e Ca²⁺	Thermo Fisher Scientific	SH30588.02
Cellule HEK293	American Tissue Culture Collection	CRL-1573	All’arrivo, scongelare le cellule e coltivarle come descritto nel protocollo del produttore. Una volta che le cellule sono state sottoposte a un numero minimo di passaggi e crescono regolarmente, congelarne una frazione in aliquote per uso futuro e conservarle in azoto liquido. Utilizzare sempre cellule con numero di passaggi inferiore a 30. Quando le cellule coltivate superano i 30 passaggi, si raccomanda di riavviare la coltura partendo dalle aliquote conservate
Colonna di solfato di eparina	Cytiva Life Sciences	17040703
Cuscinetto di supporto per provette centrifuga ad alto volume	Corning	CLS431124	Il cuscinetto di supporto deve essere utilizzato con le provette centrifuga ad alto volume a meno che il rotore della centrifuga non disponga di appositi cuscinetti a fondo conico
Provette centrifuga ad alto volume	Corning	CLS431123-6EA	Provette centrifuga da 500 mL
Provette microcentrifuga	Fisher Scientific	05-408-129	Provetta microcentrifuga da 1,5 mL, sterilizzare prima dell’uso
Acqua di grado molecolare	Cytiva Life Sciences	SH30538.03
Salesarcosina sodica N-lauroil	Sigma Aldrich	L5125	ATTENZIONE. Indossare guanti
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP35810
Optimem, mezzo con siero ridotto	Thermo Fisher Scientific	31985070
Pipette Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	Sterilizzare prima dell’uso
Soluzione salina tamponata al fosfato (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011044	Diluire a 1x per l’uso sulle cellule
Soluzione di penicillina-streptomicina	Cytiva Life Sciences	SV30010
Plasmide pHelper	Progettazione ex novo o ottenuto da un deposito di plasmidi	NA
Bacile per pipette	Thermo Fisher Scientific	13-681-502	Acquistare bacili sterili per pipette
Etere polietilenico tert-ottilfenilico (Triton X-100)	Thermo Fisher Scientific	9002-93-1	ATTENZIONE. Indossare guanti
Polietilenimina (PEI)	Polyscience	24765-1	Seguire le istruzioni del produttore per preparare una soluzione da 1 L. Filtrare con filtro da 0,22 μm e conservare a 4°C
Plasmide pTrangene	Progettazione ex novo o ottenuto da un deposito di plasmidi	NA	Deve contenere il poliA di SV40 nel genoma per essere compatibile con la titolazione AAV della sezione 5.0
Tubulatura per pompa	Cole-Parmer	RK-96440-14	Ottimizzare la lunghezza della tubulatura e il contenimento del virus nelle frazioni E1-E5
Idrrossido di sodio (NaOH)	Thermo Fisher Scientific	SS266-4
Blu di tripano	Bio-Rad	1450021