Trasduzione di embrioni di ratto fecondati basata su vettori lentivirali

Abstract

Fonte: Koza, P., et al. Generazione di Ratti Transgenici mediante un Approccio con Vettore Lentivirale. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video illustra la somministrazione assistita da microiniezione di vettori lentivirali in embrioni di ratto fecondati, al fine di ottenere un'integrazione stabile del transgene per la generazione di ratti transgenici.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica sugli animali competente.

1. Microiniezione di vettori lentivirali nell'embrione allo stadio a una cellula sotto la zona pellucida
   NOTA: Utilizzare embrioni allo stadio a una cellula con due pronuclei visibili per la microiniezione (Figura 1).
   1. Scongelare l'aliquota di lentivirus (LV) a temperatura ambiente e centrifugare a 10.000 x g e temperatura ambiente (RT) per 2 minuti per raccogliere eventuali detriti cellulari residui.
   2. Configurazione della microiniezione
      1. Preparare le pipette di ritenzione in vetro (capillare in vetro borosilicato) utilizzando un microforgiatore. Tirare il capillare di vetro su una fiamma per ottenere una punta lunga 5–10 cm. Spezzare la pipetta lasciando una punta di circa 4 cm. Il diametro esterno dovrebbe essere di circa 80–120 µm.
         NOTA: Assicurarsi che la punta della pipetta sia perfettamente dritta e liscia.
      2. Montare la pipetta tirata su un microforgiatore con la punta davanti al filamento riscaldante. Riscaldare il filamento molto vicino alla punta della pipetta e lasciarla restringere fino a un diametro di circa 15 µm (circa il 20% della dimensione dell'embrione). Posizionare la pipetta perpendicolarmente al filamento riscaldante, a 2–3 mm dalla punta della pipetta, e iniziare a riscaldare. Il vetro si ammorbidirà. Riscaldare fino a raggiungere un angolo di 15°.
      3. Preparare capillari in vetro borosilicato per microiniezione con filamento utilizzando un tiratore di pipette. Inserire il capillare nella camera di trazione. Eseguire un test di rampa (la prima volta per un nuovo vetro e ogni volta dopo aver sostituito il filamento). Impostare il valore di Calore a rampa -10, Trazione a 100, Velocità a 150 e Tempo a 100.
         NOTA: Modificare i parametri per ottenere un capillare di iniezione ottimale.
      4. Sotto una cappa a flusso laminare in condizioni di biosicurezza, caricare circa 2 µL della soluzione virale nella pipetta di microiniezione utilizzando una punta microloader.
      5. Preparare una piastra per microiniezione (coperchio di una piastra di Petri da 60 mm) con una goccia da 100 µL di mezzo M2 (al centro), ricoperta con paraffina liquida o olio minerale.
      6. Montare la pipetta di ritenzione e il capillare per microiniezione caricato con soluzione virale su un micromanipolatore e sulla piastra per microiniezione sotto un microscopio invertito.
   3. Eseguire la microiniezione
      1. Trasferire 15–20 embrioni allo stadio a una cellula sulla goccia di M2 presente sulla piastra per microiniezione. Trattenere l'embrione utilizzando una pipetta di ritenzione.
      2. Utilizzando un ingrandimento di 400x, iniettare la soluzione LV sotto la zona pellucida nello spazio perivitellino mediante il capillare di vetro collegato a un iniettore automatico. Mantenere il capillare sotto la zona pellucida per un momento.
         NOTA: Applicando una leggera pressione positiva, la soluzione virale fuoriesce continuamente dal capillare di iniezione, ma il volume della sospensione somministrata non può essere controllato.
      3. Utilizzando una pipetta fine, riposizionare gli embrioni nella piastra di coltura all'interno dell'incubatrice a 37 °C in un'atmosfera al 5% di CO₂. Il numero di iniezioni per un singolo zigote può variare ed essere adattato in base alla concentrazione del vettore virale.
         NOTA: Gli embrioni iniettati possono essere trasferiti a madri surrogate allo stadio a una cellula oppure incubati O/N in mezzo M16 prima di essere trasferiti allo stadio a due cellule. Si deve evitare una prolungata coltura in vitro di embrioni di ratto.

Risultati

Figura 1. Fotografia microscopica di un embrione di ratto allo stadio a una cellula, preparato per l'iniezione subzonale del vettore lentivirale. L'embrione è stato immobilizzato con una pipetta di ritenzione. Sono visibili i due pronuclei che contengono il materiale genetico materno e paterno e il globulo polare. Barra della scala = 20 μm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Assemblaggi di tubi aspiratori per pipette micrometriche calibrate	Sigma	A5177-5EA
Cappillari in vetro borosilicato con filamento GC100TF-15	Harvard Apparatus Limited	30-0039	Pipetta di iniezione
Piastra per colture cellulari CELLSTAR da 35 mm	Greiner Bio-One	627160
Piastra per colture cellulari CELLSTAR da 60 mm	Greiner Bio-One	628160
Olio minerale	Sigma	M8410-500ML
Microscopio invertito	Zeiss	Axiovert 200
Mezzo M2	Sigma	M7167
VacuTip	Eppendorf	5175108	Pipetta portatrice
Mezzo M16 EmbryoMax	Sigma	MR-016-D