Purificazione dell'integrasi virale mediante cromatografia di affinità

Abstract

Fonte: Lopez Jr., M. A., et al. Rilevamento e rimozione della contaminazione da nucleasi durante la purificazione dell'integrasi ricombinante del prototipo del virus della foamy. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video illustra la purificazione della integrasi virale marcati con poliistidina mediante cromatografia di affinità al nichel. Il protocollo utilizza un'eluizione con gradiente di imidazolo per isolare selettivamente l'integrasi in base alla sua affinità per la resina caricata con nichel.

Protocollo

1. Cromatografia per affinità al nichel

1. Scongelare un pellet batterico sul ghiaccio.
   NOTA: Questo richiederà un tempo considerevole (circa 2 - 3 h). Quando il pellet si sarà scongelato fino a formare una sospensione cellulare, aggiungere un'ulteriore 500 μM Fluoruro di fenilmetanosolfonile (PMSF) (soluzione stock 100 mM).
2. Mantenere il tubo da 50 mL di sospensione batterica sul ghiaccio. Sonicare i batteri a un'ampiezza del 30% per 30 s (1 s acceso, 1 s spento) per ogni pellet ottenuto da 1 L di coltura, utilizzando un sonicator con un bio horn di diametro 0,5 pollici dotato di microtip conico di diametro 0,125 pollici, una frequenza di 20 kHz e una potenza massima di 400 W.
3. Trasferire il campione cellulare in un tubo per ultracentrifuga freddo. Utilizzare contenitori in policarbonato (diametro 25 mm, altezza 89 mm) compatibili con un rotore fisso di tipo 60 Ti. È possibile utilizzare tubi e rotori alternativi se si raggiunge la stessa forza gravitazionale. Centrifugare a 120.000 x g per 60 min a 4 °CDovrebbe essere presente un pellet evidente. Il surnatante potrebbe avere un colore giallo.
4. Trasferire il soprannatante versandolo o con una pipetta in un tubo conico da 50 mL freddo. Registrare il volume; questo volume dovrebbe essere approssimativamente pari al volume del buffer di risospensione utilizzato prima del congelamento rapido. Se il soprannatante è viscoso, potrebbe essere contaminato da DNA batterico, il quale potrebbe ostruire la colonna cromatografica. In tal caso, ripetere l'ultracentrifugazione per sedimentare il DNA batterico.
5. Preparare 500 mL di Buffer A (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF) e 500 mL di Buffer B (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM NaCl, 500 μM PMSF, 200 mM imidazolo).
   NOTA: In questo protocollo, mantenere il sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (FPLC), tutti i tamponi e il campione a 4 °C in una stanza fredda.
   1. Filtrare sterilmente i Buffer A e B con 0.2 μm unità filtranti monouso. A seconda del sistema FPLC, lavare la pompa A e la pompa B rispettivamente con Buffer A e Buffer B. Far passare attraverso il sistema il 90% di Buffer A e il 10% di Buffer B fino a quando i valori di conducibilità e di assorbanza ultravioletta (UV) non si stabilizzano. La portata massima dipenderà dall'apparecchiatura; utilizzare una portata di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.
6. Preparare una colonna FPLC lunga 110 mm e con diametro di 5 mm, contenente 1,5 mL di resina caricata con nichel (capacità di legame massima 50 mg/mL, pressione massima 1 MPa). La colonna può essere preparata il giorno precedente la purificazione e conservata a 4 ˚C.
7. Collegare la colonna allo strumento FPLC. Equilibrare la colonna con 20 mL di una miscela costituita da 90% Buffer A e 10% Buffer B (20 mM imidazolo) a un flusso di 0,5 mL/min con un limite massimo di pressione di 0,5 MPa. Lo strumento deve raccogliere in tempo reale i dati di conducibilità e di assorbanza UV a 280 nm (A₂₈₀). La conducibilità e le letture UV dovrebbero stabilizzarsi. Se queste letture non si stabilizzano, continuare a far passare i tamponi attraverso la colonna fino a quando non diventano stabili.
8. Caricare il campione proteico (~10 mL per pellet) sulla colonna a una velocità di flusso di 0,15 mL/min con un limite massimo di pressione di 0,5 MPa. La velocità di flusso e la pressione della colonna rimangono costanti per tutta la durata della purificazione. Raccogliere il flusso in uscita in un tubo da 50 mL.
   1. Lavare la colonna con 20 mL di 90% Buffer A e 10% Buffer B. Raccogliere il lavaggio in un tubo da 50 mL. Eluire le proteine con un gradiente lineare di 20 mL dal 10% al 100% di Buffer B (da 20 mM a 200 mM di imidazolo).
   2. Infine, lavare la colonna con 5 mL di Buffer B al 100% (200 mM imidazolo). Raccogliere il gradiente e l'ultimo lavaggio in frazioni da 0,27 mL.
9. Combina 15 μL di tampone campione 2x per SDS-PAGE con 15 μL del flusso in uscita, del lavaggio e del picco A₂₈₀ frazioni. Far bollire i campioni per 3 min.
   1. Preparare due gel di elettroforesi SDS-PAGE al 10%. Caricare 10 μL di ogni campione sui gel e 4 μL di standard proteici precolorati. Eseguire l'elettroforesi, colorare e analizzare i gel.
   2. Unire le frazioni che appaiono contenere integrasi del prototipo del virus della schiuma (PFV IN) quasi pura in base all'ispezione visiva. Misurare il volume mediante pipettaggio, tipicamente 8 - 10 mL.
   3. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare l'assorbanza a 280 nm (A₂₈₀ delle frazioni combinate e calcolare la quantità totale di proteina PFV IN; il rendimento tipico è di circa 10 mg per litro di coltura indotta. Il coefficiente di estinzione di PFV IN con il tag esamericidistidinico è 59360 cm⁻¹ M⁻¹.^-1 M^-1.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BL21/DE3 Rosetta E. coli	EMD Millipore	70956-4
Imidazolo	Sigma-Aldrich	I0250
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430