Purificazione dell'integrasi virale mediante cromatografia di affinità con eparina

Abstract

Fonte: Lopez Jr., M. et al. Rilevamento e rimozione della contaminazione da nucleasi durante la purificazione dell'integrasi ricombinante del virus della schiuma prototipico. J. Vis. Exp. (2017)

In questo video viene illustrata la procedura per la purificazione dell'integrasi virale da contaminazione da nuclease batteriche mediante cromatografia su colonna a eparina Sepharose, seguita da analisi SDS-PAGE per confermare la purezza della proteina.

Protocollo

1. Cromatografia di affinità con eparina
   1. Preparare 250 mL del Buffer C (50 mM cloridrato di tris(idrossimetil)aminometano (Tris-HCl), pH 7,5, 10 mM ditiotreitolo (DTT), 0,1 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), 500 μM fluoruro di fenilmetilsulfonile (PMSF)) e 250 mL del Buffer D (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 500 μM PMSF, 1 M NaCl).
      NOTA: In questo protocollo, il sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni per proteine (FPLC), i buffer e il campione vengono mantenuti in una stanza fredda a 4 ˚C.
      1. Filtrare sterilmente i Buffer C e D utilizzando unità filtranti monouso da 0,2 μm. A seconda del sistema FPLC, lavare la pompa A e la pompa B rispettivamente con il Buffer C e il Buffer D. Far passare attraverso il sistema una miscela costituita da 80% Buffer C e 20% Buffer D fino a quando le letture di conducibilità e ultravioletto (UV) si stabilizzano. La velocità di flusso massima dipenderà dall'apparecchiatura; solitamente utilizziamo una velocità di flusso di 5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa.
   2. Preparare una colonna FPLC lunga 80 mm e con diametro di 5 mm, contenente 1 mL di resina eparina Sepharose (capacità di legame massima 2,0 mg di antitrombina III bovina per mL di resina; pressione massima 1,4 MPa). La colonna può essere preparata il giorno precedente la purificazione e conservata a 4 °C. Collegare la colonna allo strumento FPLC.
      1. Equilibrare la colonna con 20 mL di una miscela costituita da 80% Buffer C e 20% Buffer D (200 mM NaCl) a una velocità di flusso di 0,5 mL/min con un limite di pressione massima di 1 MPa. Lo strumento deve raccogliere in tempo reale i dati relativi alla conducibilità e all'assorbanza UV a 280 nm (A₂₈₀). Le letture di conducibilità e UV devono stabilizzarsi. Se tali letture non si stabilizzano, continuare a far passare i buffer attraverso la colonna finché non diventano stabili.
   3. Ridurre la concentrazione di NaCl del campione di integrasi del virus spumoso prototipico (PFV IN) a 200 mM aggiungendo 1,5 volumi del Buffer C. Ad esempio, aggiungere 15 mL di Buffer C a 10 mL di PFV IN. Il volume totale è tipicamente di circa 25 mL.
   4. Caricare il campione di PFV IN diluito sulla colonna di eparina Sepharose a una velocità di flusso di 0,5 mL/min con un limite di pressione massima di 1,0 MPa. La velocità di flusso e la pressione della colonna rimangono costanti per tutta la durata della purificazione. Raccogliere il flusso iniziale in un tubo conico da 50 mL.
      1. Lavare la colonna con 20 mL di una miscela costituita da 80% Buffer C e 20% Buffer D (200 mM NaCl), raccogliendo il lavaggio in un tubo conico da 50 mL. Eluire la colonna con un gradiente lineare di 30 mL dal 20% al 100% di Buffer D (da 200 mM a 1 M NaCl).
      2. Lavare la colonna con 5 mL di Buffer D al 100%. Raccogliere il gradiente e l'ultimo lavaggio in frazioni da 0,37 mL.
   5. Analizzare il campione iniziale, il flusso iniziale, il lavaggio e le frazioni mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di dodecilsolfato di sodio all'8% (SDS-PAGE). La PFV IN, dopo il distacco del tag esacistidinico, ha un peso molecolare di 44.394 Da e il coefficiente di estinzione rimane pari a 59.360 cm^-1 M^-1 in assenza del tag esacistidinico. Conservare tutte le frazioni a 4 ˚C fino al completamento del saggio nucleasico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside)	Denville Scientific	CI8280
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
PMSF (Fluoruro di fenilmetansulfonile)	Amresco	754
DTT (Ditiotreitolo)	P212121	SV-DTT
EDTA UltraPure	Invitrogen/Gibco	15575
Heparin Sepharose 6 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0998-01