Questo video descrive il saggio di placca virale utilizzando particelle di pseudovirus del coronavirus. Lo pseudovirus diluito viene aggiunto a un monostrato di cellule di mammifero, seguito da incubazione con un'aggiunta di metilcellulosa. Le placche formate dalle cellule infette vengono contate visivamente per determinare il titolo infettivo del virus.
Articolo metodologico
Quantificazione delle particelle di pseudovirus tramite saggio di placca
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Titolazione del virus della stomatite vescicolare che esprime la proteina spike del coronavirus e la proteina verde fluorescente migliorata (pseudovirus VSV-S-eGFP)
1. Diluizione seriale per determinare il titolo virale
1. Piastrare le cellule Vero E6 in piastre a 6 pozzetti a una densità di semina di 6 × 105 cellule per pozzetto in Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM (con il 10% di FBS (siero fetale bovino)), e incubare tutta la notte a 37 °C con il 5% di CO₂.
NOTA: possono essere utilizzate anche cellule Vero che sovraesprimono TMPRSS2 e hACE2.
2. Preparare una serie di diluizioni seriali decrescenti di 10 volte del virus VSV-SeGFP in DMEM freddo privo di siero, aggiungendo 900 μL di mezzo in sette provette microcentrifuga. Etichettare le provette da 1 a 7. Aggiungere 100 μL del ceppo virale alla prima provetta e vortexare brevemente. Trasferire 100 μL di virus diluito dalla provetta 1 alla provetta 2 e vortexare brevemente; continuare fino alla provetta 7.
3. Aspirare il mezzo da tutti i pozzetti della piastra a 6 pozzetti contenente cellule Vero E6 e sostituirlo con 500 μL di diluizioni da 105 a 107. Incubare le piastre per 45 min a 37 °C con 5% di CO₂, agitando delicatamente ogni 15 min.
Aspirare l'inoculo e sostituirlo con uno strato di copertura contenente una miscela 1:1 di DMEM 2x e carbossimetilcellulosa (CMC) al 6%, concentrazione finale di CMC al 3%, integrata con il 10% di FBS; incubare a 34 °C con il 5% di CO₂ per 48 h.
NOTA: Riscaldare preventivamente la miscela di sovrapposizione in un bagno a 37 °C per 15 minuti durante il passaggio di infezione. Una miscela 1:1 di agarosio al 1% con DMEM 2x integrato con FBS al 10% può essere utilizzata al posto del CMC. Per la sovrapposizione con agarosio, far bollire l'agarosio al 1% (in dH₂O) e mescolarlo con DMEM 2x freddo. Verificare che la miscela abbia una temperatura adeguata prima di aggiungerla al monostrato cellulare (circa 37-40 °C). Se si utilizza agarosio per la sovrapposizione, le cellule devono essere fissate mediante incubazione in 2 mL di metanolo:acido acetico 3:1 per almeno un'ora prima della colorazione.
2. Colorazione e calcolo del titolo virale
1. Visualizzare le placche colorandole con violetto di cristallo o mediante la visualizzazione diretta di eGFP al microscopio a fluorescenza.
2. Per colorare le piastre, aspirare il sovrasprito, lavare una volta con PBS, quindi aggiungere 2 mL di violetto di cristallo 0,1% (in metanolo 80% e dH₂O) in ogni pozzetto. Posizionare su un agitatore per piastre per circa 20 min a temperatura ambiente prima della decolorazione. Rimuovere il violetto di cristallo e lavare delicatamente ogni pozzetto due volte usando dH₂O o PBS.
NOTA: I passaggi di lavaggio e colorazione devono essere eseguiti delicatamente pipettando lentamente lungo il lato di ciascun pozzetto per garantire che il monostrato cellulare rimanga integro per tutta la durata della procedura.
3. Lasciare asciugare le piastre per almeno 1 h prima di contare le placche. Assicurarsi che i conteggi delle placche siano effettuati su pozzetti contenenti da 20 a 200 placche. Per calcolare il titolo del virus in unità formanti placca (PFU) per mL, moltiplicare il fattore di diluizione del pozzetto contato per il volume di infezione, quindi dividere questo numero per il numero di placche presenti nel rispettivo pozzetto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tripsina-EDTA allo 0,25% (Gibco) | Fisher scientific | LS25200114 | |
| cellule Vero E6 | ATCC | CRL-1586 | |
| carbossimetilcellulosa | Sigma | C5678 | |
| mezzo Dulbecco modificato di Eagle (Gibco) | Fisher scientific | 10-013-CV | |
| mezzo Dulbecco modificato di Eagle (in polvere) (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 12-800-017 | |
| soluzione salina tamponata al fosfato di Dulbecco (DPBS) | Fisher scientific | 21-031-CV | |
| penicillina/streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| anticorpo neutralizzante anti-Spike di SARS-CoV-2 (2019-nCoV), Ig monoclonale di topo | SinoBiological | 40592-MM57 |
