Neutralizzazione mediata da anticorpi di pseudovirus che esprimono la proteina Spike del coronavirus mediante l'uso di siero di paziente

Abstract

Fonte: Jamieson, T. R., et al. Rilevamento di anticorpi neutralizzanti per SARS-CoV-2 mediante imaging fluorescente ad alta capacità di infezione da pseudovirus. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra la neutralizzazione mediata da anticorpi di pseudovirus portatori di proteine spike di coronavirus utilizzando siero di pazienti, studiata mediante imaging fluorescente ad alta capacità di monociti epiteliali infetti.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono il prelievo di campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida del comitato etico (IRB) dell'istituto.

1. Diluizioni di anticorpi o sieri e infezioni

NOTA: Questo protocollo può essere applicato per misurare la neutralizzazione del virus della stomatite vescicolare che esprime la proteina spike del coronavirus e la proteina verde fluorescente migliorata (pseudovirus VSV-S-eGFP) da parte di anticorpi disponibili in commercio e siero di pazienti, nonché siero raccolto da animali per studi pre-clinici di sviluppo vaccinale.

1. Serie di diluizioni seriali
   1. Prima di diluire i campioni di siero, inattivare termicamente ciascun campione in un bagno a 56 °C per 30 minuti per inattivare il complemento. Assicurarsi di adottare le necessarie precauzioni di sicurezza durante la manipolazione dei campioni di pazienti; aprire i contenitori dei campioni solo all'interno della cappa a flusso laminare per colture cellulari e indossare dispositivi di protezione individuale adeguati al livello di contenimento 2.
   2. Preparare la serie di diluizioni in una piastra vuota a 96 pozzetti (Piastra 1).
   3. Iniziare tutte le diluizioni nella riga A della piastra a 96 pozzetti con un volume di 80 µL. *Per i campioni di pazienti, iniziare la serie di diluizioni con un rapporto di 1 su 10, aggiungendo 8 µL di siero a 72 µL di mezzo DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) privo di siero (con 1% di penicillina/streptomicina).
      NOTA: La concentrazione dell'anticorpo neutralizzante utilizzata dipenderà dall'attività prevista dal produttore. Per l'anticorpo neutralizzante anti-Spike di SARS-CoV-2 utilizzato in questo caso (vedere la Tabella dei Materiali), iniziare con una concentrazione di 5 µg/mL per osservare almeno il 50% di neutralizzazione.
   4. Aggiungere 40 µL di DMEM privo di siero (con 1% di penicillina/streptomicina) alle righe da B a G e 80 µL alla riga H. Non aggiungere il virus alla riga H, poiché funge da controllo con sole cellule.
   5. Utilizzando una pipetta multicanale a 12 canali, mescolare e trasferire 40 µL di siero o anticorpo diluito dalla riga A alla riga B. Mescolare e ripetere fino alla riga F, scartando 40 µL dalla riga F. Non aggiungere siero alla riga G, poiché rappresenta la riga di controllo con solo virus.
2. Infezione e sovrapposizione
   1. Preparare un volume adeguato di VSV-S-eGFP diluito per trattare ciascun pozzetto con una multiplicità di infezione (MOI) pari a 0,05 (o 2000 unità formanti placche (pfu)). (Nel calcolo, tenere presente che solo 60 µL del volume totale di 80 µL verranno trasferiti sulle cellule; pertanto, moltiplicare il volume del virus per 1,33 per mantenere 2000 pfu).
      NOTA: Poiché VSV-S-eGFP è sensibile alla temperatura, assicurarsi che le scorte virali rimangano sul ghiaccio quando non vengono utilizzate e evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento poiché i titoli possono variare dopo congelamenti ripetuti.
   2. Aggiungere 40 µL di virus diluito a ciascun pozzetto delle righe da A a G della Piastra 1 e mescolare aspirando e dispensando 4-5 volte. Incubare la piastra per 1 h a 37 °C con 5% di CO₂.
   3. Rimuovere la piastra contenente le cellule dall'incubatrice (Piastra 2) ed aspirare con attenzione il mezzo da tutti i pozzetti. Trasferire 60 µL della miscela anticorpo/virus dalla Piastra 1 alla Piastra 2 e incubare per 1 h a 37 °C con 5% di CO₂, agitando delicatamente la piastra ogni 20 minuti.
   4. Aggiungere a ogni pozzetto 140 µL di sovrapposizione contenente carbossimetilcellulosa (CMC) in DMEM per una concentrazione finale di 3% di CMC (con 10% di FBS (siero fetale bovino) e 1% di penicillina/streptomicina). Posizionare la Piastra 2 in un'incubatrice impostata a 34 °C con 5% di CO₂ per circa 24 h prima dell'acquisizione delle immagini.
      NOTA: Riscaldare preventivamente la miscela di sovrapposizione in un bagno a 37 °C per 15 minuti durante il passaggio di infezione.

2. Acquisizione delle immagini e quantificazione (Giorno 3)

1. Acquisire le immagini delle piastre utilizzando un lettore fluorescente automatico (con un filtro per isotiocianato di fluoresceina (FITC) o un filtro alternativo con una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm). Quantificare l'infezione virale creando un protocollo che identifichi e conti automaticamente i singoli focolai di eGFP (proteina verde fluorescente potenziata). Se non è disponibile una funzione di conteggio automatico, utilizzare il software ImageJ per quantificare il numero di focolai di eGFP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cellulosa carbossimetilica	Sigma	C5678
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (Gibco)	Fisher scientific	10-013-CV
Mezzo Dulbecco modificato di Eagle (in polvere) (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	12-800-017
Cellule Vero E6	ATCC	CRL-1586
Soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS)	Fisher scientific	21-031-CV