Monitoraggio dell'espressione genica specifica per ogni stadio nel virus vaccinia mediante reporter fluorescenti

Abstract

Fonte: Rozelle, D. K., et al. Virus reporter della vaccinia per la quantificazione della funzione virale in tutte le fasi dell'espressione genica. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video dimostra un metodo per monitorare la replicazione del virus vaccinia mediante reporter fluorescenti regolati da promotori specifici per ciascuna fase. L'espressione sequenziale di proteine fluorescenti verdi, rosse e blu indica le fasi precoce, intermedia e tardiva dell'infezione, consentendo un'analisi ad alto rendimento dell'espressione genica virale specifica per ogni fase.

Protocollo

1. Piastrare le cellule

1. Dissociare le cellule HeLa dalla piastra e diluirle nel mezzo di crescita (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 2 mM L-glut, 10% siero bovino fetale [FBS]) fino a circa 2,0 x 10⁵ cellule/ml. Distribuire 100 μl/pozzetto in una piastra da 96 pozzetti con pareti nere e fondo trasparente e piatto (20.000 cellule/pozzetto).
2. Incubare le cellule per 24 ore fino a confluenza in un incubatore a 37 °C + 5% CO₂.

2. Infetta le cellule

1. Diluire i virus e infettare le cellule.
   1. Scongelare il virus fluorescente TrpV (virus triplo; Venus precoce, mCherry intermedio, TagBFP tardivo) e PLV (Venus privo di promotore) e disgregare mediante sonificazione per 5 minuti. In alternativa, i ceppi virali grezzi possono essere mescolati in rapporto 1:1 con tripsina 0,25 mg/ml nel mezzo di infezione e incubati a 37 °C per 30 min.
   2. Diluire i ceppi virali grezzi nel mezzo di infezione a 37 °C (DMEM, 2 mM L-glut, 2% FBS). Per infezioni ad alto MOI (10 PFU/cellula), diluire il ceppo virale a 1,0 x 10⁷ PFU/ml assumendo 5 x 10⁴ cellule/pozzetto e un volume di inoculo di 50 μl. Prevedere l'infezione di 3 pozzetti replicati per ogni trattamento con TrpV e altri 3 pozzetti replicati per lo stesso trattamento con PLV, per tenere conto della fluorescenza di fondo specifica di ciascun trattamento.
   3. Infettare i pozzetti aggiungendo 50 μl/pozzetto di virus diluito nel mezzo di infezione. Questo momento è definito come tempo = 0 ore post-infezione (0 hpi).
2. Incubare da 6 a 24 ore in un incubatore a 37 °C + 5% CO₂.

3. Fissare le cellule

1. Fissare le cellule aggiungendo 100 μl di paraformaldeide al 8% al mezzo di infezione già presente in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.
   NOTA: Si raccomanda di aggiungere direttamente il paraformaldeide 2x (8%) al mezzo di infezione per evitare l'aerosolizzazione del vaccinia infettivo, che potrebbe verificarsi se il mezzo ad alta titolazione venisse rovesciato direttamente nel contenitore dei rifiuti prima della fissazione.
2. Rimuovere il fissativo capovolgendo la piastra nel contenitore dei rifiuti.
3. Aggiungere 100 μl di soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente.
4. Sigillare la piastra con un film adesivo otticamente trasparente.
   NOTA: Le piastre possono essere conservate a 4 °C se non vengono lette immediatamente. Assicurarsi di riportare le piastre sigillate a temperatura ambiente prima della lettura per evitare che la condensa alteri le misurazioni dello spettrofotometro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM)	Gibco	11995-065
Serum bovino fetale - Optima, inattivato termicamente (FBS)	Atlanta Biologicals	S12450H
L-Glutamina 200 mM (L-glut)	Gibco	25030-081
Piastre microtest in polistirene nero, trasparenti sul fondo piatto, trattate per coltura cellulare, 96 pozzetti	Corning	3603
Soluzione salina tamponata al fosfato (PBS)	Gibco	10010-023
Film otticamente trasparente TempPlate RT	USA Scientific	2978-2700
Mezzo Opti-MEM a ridotto contenuto di siero	Gibco	31985-070