Isolamento e purificazione di virus da corpi di insetti infetti

Abstract

Fonte: Biesbrock, A. M. et al. Propagazione del Homalodisca coagulata virus-01 mediante coltura cellulare di Homalodisca vitripennis. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video dimostra la propagazione in vitro del Homalodisca coagulata Virus-01 utilizzando cellule ospiti derivate da insetti. Illustra i passaggi per la purificazione del virus, l'inoculazione e la replicazione all'interno di cellule di insetto coltivate.

Protocollo

1. Estrazione del virus intero

1. Omogeneizzare interi corpi di H. vitripennis positivi al virus in tampone fosfato, pH ~7,2, con il 0,02% di dietilditiocarbammato di sodio triidrato (DETCA) agitando a vortice per intervalli di ~10 secondi fino a quando non sono più presenti grossi grumi di tessuto. Estrarre il virus mediante centrifugazione ad alta velocità a 124.500 x g per 4 ore a 4 °C oppure a 22.000 x g per 16 ore a 4 °C. Se si forma un precipitato in superficie, rimuoverlo con un batuffolo di cotone sterile.
2. Eliminare il soprannatante.
3. Raccogliere il pellet e scioglierlo con 5 ml di tampone fosfato 10 mM (senza DETCA), pH ~7,2, contenente lo 0,4% di acido Na-deossicolico e il 4% di etere esadecilico del polietilene glicole (Brij 52).
   1. Per mescolare bene il pellet, rimuoverlo dalla parete del tubo e frantumarlo finché non è completamente in soluzione, se necessario.
   2. Aggiungere ulteriore tampone fosfato 10 mM a incrementi di ~5 ml per favorire la solubilizzazione del pellet, se necessario, e unire il tutto in 2 tubi.
4. Centrifugare la soluzione a 300 x g per 15 minuti.
5. Rimuovere il soprannatante e far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,45 μm, raccogliendo il filtrato in un tubo di raccolta grande.
6. Trasferire il filtrato in una membrana da dialisi con cutoff di peso molecolare (MWCO) di 3,5 kD, utilizzando piccole quantità di tampone fosfato 10 mM (pH 7) senza DETCA, se necessario.
7. Collocare la membrana da dialisi in un grande becher riempito con ddH₂O a 4 °C. Cambiare l'acqua ddH₂O ogni ora per 5-6 ore, fino a quando si forma un precipitato bianco all'interno della membrana.
8. Raccogliere il virus purificato dalla membrana e sottoporre la soluzione virale al 100% a una serie di diluizioni decrescenti aggiungendo 10 μl di soluzione a 90 μl di ddH₂O. Successivamente, aggiungere 10 μl della diluizione ad altri 90 μl di ddH₂O fino a raggiungere una diluizione di 1:100.000.
9. Conservare la soluzione virale a -80 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Flaconi per colture cellulari Corning	Sigma Aldrich	CLS430168	Superficie 25 cm², collo inclinato, tappo (sigillo a spina)
Olympus DP30BW, IX2-SP, IX71	Olympus		Microscopio invertito e fotocamera
Piastre per colture multiwell Greiner CELLSTAR	Sigma Aldrich	M8937	48 pozzetti (trattati per colture cellulari, con coperchio)
DETCA	Sigma Aldrich	228680	Triidrato di dietilditiocarbammato di sodio
Sistema per filtrazione a vuoto con imbuto a bottiglia Corning	Sigma Aldrich	CLS431206	Membrana di acetato di cellulosa, dimensione dei pori 0,45 μm, area della membrana 54,5 cm², capacità del filtro 500 ml
Brij 52	Sigma Aldrich	388831	Etere esadecilico del polietilene glicole
Soluzione tampone fosfato	Sigma Aldrich	P5244	Ricevuta come 100 mM, diluita a 10 mM con acqua sterile
PBS	Sigma Aldrich	P5368	Soluzione salina tamponata al fosfato
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Mezzo per insetti di Grace (supplementato, 1x)	Sigma Aldrich	G8142	Componente del mezzo per cicaline H2G+
L-istidina monoidrato	Sigma Aldrich	H8125	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Mezzo 199 (10x)	Sigma Aldrich	M4530	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Mezzo 1066 (1x)	Sigma Aldrich	C0422	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Sali bilanciati di Hank (1x)	Sigma Aldrich	51322C	Componente del mezzo per cicaline H2G+
L-Glutammina (100x)	Sigma Aldrich	G3126	Componente del mezzo per cicaline H2G+
MEM, miscela di aminoacidi (50x)	Sigma Aldrich	56419C	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Soluzione di MgCl 1 M	Sigma Aldrich	M8266	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Pen-Strep	Sigma Aldrich	G6784	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Nistatina	Sigma Aldrich	N6261	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Gentamicina	Sigma Aldrich	46305	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Destrosio	Sigma Aldrich	D9434	Componente del mezzo per cicaline H2G+
Siero fetale bovino	Sigma Aldrich	F2442	Componente del mezzo per cicaline H2G+