Generazione di lentivirus ricombinanti in cellule di mammifero

In questo articolo

Abstract

Fonte: Zhang, Y., et al., Riprogrammazione Diretta di Fibroblasti Murini in Melanociti. J. Vis. Exp. (2021)

Questo video illustra la produzione e la concentrazione di lentivirus ricombinante in cellule di mammifero, consentendo un efficiente trasferimento genico di fattori di trascrizione o altri elementi genetici per applicazioni come la riprogrammazione cellulare, studi funzionali e ricerche terapeutiche potenziali.

Protocollo

1. Costruzione di un sistema concentrato di confezionamento di lentivirus per fattori di trascrizione

Produzione del virus concentrato (Figura 1A, B)
1. Piastriare 1,5 × 10⁶ cellule HEK (renee embrionali umane)-293T in una piastra da 60 mm e coltivare queste cellule con mezzo normale (vedere Tabella 1) a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂.
  NOTA: Se il virus deve essere confezionato in lotti, si può utilizzare una piastra per coltura cellulare da 100 mm (per dettagli, vedere Tabella 2).
2. Dopo 24 h, assicurarsi che le cellule HEK-293T abbiano raggiunto una confluenza dell'80-90% nel giorno della trasduzione e sostituire il mezzo con 3,5 mL di DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) (150 µL di DMEM per 1 cm²). Lasciare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato con 5% di CO₂ per 2 h.
  NOTA: Il mezzo sostitutivo deve essere privo di siero, in modo che le cellule possano essere "privati di nutrimento" per una migliore trasfezione del plasmide.
3. Preparare la miscela di plasmidi (miscela A) contenente 3 µg dei plasmidi bersaglio Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 o Snai2; 1 µg del plasmide di confezionamento PMD2.G e 2 µg del plasmide di confezionamento PSPAX2. Portare il volume della miscela A a 150 µL con DMEM privo di siero. Preparare la miscela del reagente di trasfezione (miscela B) aggiungendo 12 µL del reagente di trasfezione (il volume è il doppio della massa totale di tutti i plasmidi) e portare il volume della miscela B a 150 µL con DMEM privo di siero.
  NOTA: Durante la preparazione delle miscele, è importante aggiungere il liquido lentamente per evitare bolle d'aria.
4. Mescolare la miscela A e la miscela B dopo averle lasciate a riposo per 5 min a temperatura ambiente. Incubare la miscela a temperatura ambiente per 20-30 min per formare il complesso di trasfezione.
5. Prelevare le cellule HEK-293T dall'incubatore, sostituire il mezzo con DMEM + 2% FBS (siero fetale bovino), aggiungere la miscela del passaggio 1.1.4 goccia a goccia e mescolare delicatamente il liquido.
6. Dopo 8 h, cambiare il mezzo con 3,5 mL di mezzo normale. Dopo il cambio del mezzo, raccogliere il sopranatante virale ogni 24 h e 48 h.
7. Mescolare i sopranatanti virali raccolti in due diversi momenti temporali. Centrifugare a 200 × g per 5 min a 4 °C. Far passare il sopranatante attraverso filtri da 0,45 µm e raccoglierlo in un tubo conico sterile da 50 mL.
  NOTA: Il virus raccolto a 24 h può essere conservato a 4 °C e mescolato con il virus raccolto a 48 h.
8. Concentrare il sopranatante virale centrifugando a 6000 × g a 4 °C per tutta la notte (~16 h). Assicurarsi che il pellet virale sia visibile sul fondo del tubo conico dopo la centrifugazione.
9. Versare lentamente il sopranatante. Sciogliere il pellet virale in un volume di mezzo normale pari a 1/100^esimo del volume del sopranatante virale. Utilizzando una micropipetta P1000, aspirare e rilasciare delicatamente fino a ottenere una miscela omogenea. Dividere il virus concentrato in provette microcentrifuga secondo necessità. Conservare a −80 °C.
  NOTA: Il virus viene concentrato 100 volte con questo metodo. Il virus concentrato (100x) può essere conservato per >1 anno a −80 °C. Evitare cicli ripetuti di congelamento e scongelamento del virus.

Tabella 1: Componenti dei mezzi normali e di riprogrammazione.

	Componenti	Dose (concentrazione, volume)	Concentrazione finale
Mezzo normale (100 mL)	DMEM/GLUCOSIO ALTO	89 mL
	FBS inattivato termicamente	10 mL
	Antibiotici (Pen/Strep)	10000 U/mL, 1 mL	100 U/mL
Mezzo di riprogrammazione (100 mL)	RPMI-1640	88 mL
	FBS inattivato termicamente	10 mL
	SCF umano ricombinante	200 μg/mL, 50 μL	100 ng/mL
	bFGF umano ricombinante	4 μg/mL, 250 μL	10 ng/mL
	Insulina umana ricombinante	10 mg/mL, 50 μL	5 μg/mL
	EDN3 umano	100 μM, 100 μL	0.1 μM
	Toxina del colera	0.3 mg/mL, 0.56 μL	20 pM
	Forbolo 12-miristato 13-acetato (TPA)	1 mM, 20 μL	200 nM
	Idrocortisone	100 μg/mL, 500 μL	0.5 μg/mL
	Adenina	40 mg/mL, 60 μL	24 μg/mL

Tabella 2: Dettagli del sistema di confezionamento del lentivirus.

Piatto per coltura	Densità di semina (cellule/piatto)	Mezzo (mL)	Sistema di plasmidi			Reagente di trasfezione (µL)
Piatto per coltura	Densità di semina (cellule/piatto)	Mezzo (mL)	Plasmide bersaglio (μg)	PMD2.G (μg)	PSPAX2 (μg)	Reagente di trasfezione (µL)
35 mm	6 ×105	1.5	1.5	0.5	1	6
60 mm	1.5 × 106	3.5	3	1	2	12
100 mm	4 × 106	8	8	3	6	34

Risultati

Figura 1: Produzione del virus concentrato e stima del titolo. (A) Intensità di fluorescenza di GFP (proteina verde fluorescente) dopo l'infezione delle cellule HEK-293T con lentivirus non concentrato (1x) e lentivirus concentrato (100x) (B) Confronto tra i tassi di infezione del lentivirus non concentrato (1x) e del lentivirus concentrato (100x), rilevati mediante citometria a flusso. (C) Stima del titolo del lentivirus concentrato. Barre della scala = 250 µm. Abbreviazioni: GFP = proteina verde fluorescente; TU = unità trasduttive.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtro 0,45 μM	Millipore	SLHVR33RB
Etilene al 95%/100%	LANBAO	210106	Conservato a temperatura ambiente
Antibiotici (Pen/Strep)	Gibco	15140-122	Conservato a -20 °C
Anticorpo anti-TRP2/DCT	Abcam	ab74073	Specie ospite/Isoforma: IgG da coniglioReattività per specie: topo/uomoDiluizione 1:200 da utilizzare
DMEM (glucosio alto)	HyClone	SH30243.01	Conservato a 4 °C
DMSO	Sigma	D2650	Conservato a temperatura ambiente
FBS	Gibco	10270-106	Conservato a -20 °CInattivato termicamente prima dell'uso
Gelatina	Sigma	G9391	Conservata a temperatura ambiente
Plasmidi GFP-PURO (Mitf, Sox10, Pax3, Sox2, Sox9 e Snai2)	Hanheng Biological Technology Co., Ltd.	pHBLPm003198 pHBLPm001143 pHBLPm002968 pHBLPm002981 pHBLPm004348 pHBLPm000325	Conservati a -20 °C
Ematossilina	Abcam	ab220365	Conservata a temperatura ambiente
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente di trasfezione, conservato a 4 °C
PBS (-)	Gibco	C10010500BT	Conservato a temperatura ambiente
Forbolo 12-miristato 13-acetato (TPA)	Sigma	P8139	Concentrazione stock 1 mMConcentrazione finale 200 nM
Polybrene	Sigma	H9268	Reagente cationico polimerico per trasfezione; concentrazione stock 8 μg/µLconcentrazione finale 4 ng/µL
Puromicina	Gibco	A11138-03	Conservata a -20 °C
FGF umano ricombinante	Invitrogen	13256-029	Concentrazione stock 4 μg/mLConcentrazione finale 10 ng/mL
Insulina umana ricombinante	Sigma	I3536	Concentrazione stock 10 mg/mLConcentrazione finale 5 µg/mL