In questo video viene mostrato come un plasmide minigenomica tetracistronico, che imita il genoma del virus Ebola, venga trasfettato in cellule umane insieme a plasmidi ausiliari. All'interno delle cellule vengono espressi proteine virali e luciferasi, portando all'assemblaggio e al rilascio di particelle virali simili non patogene ma capaci di replicarsi.
Articolo metodologico
Produzione di particelle simil-virali competenti per la trascrizione e la replicazione del virus Ebola contenenti un reporter
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Trasfezione delle cellule produttrici per la produzione iniziale di particelle virali simili a virus competenti per la trascrizione e la replicazione o trVLPs
- 24 ore dopo la suddivisione delle cellule (vedere Figura 1 per una panoramica dei tempi dell'esperimento), pipettare il DNA plasmidico (per le quantità vedere Tabella 1) in una cryovial sterile da 2 mL utilizzando punte filtrate. Aggiungere 100 µL di OptiMEM per pozzetto al DNA. Vortexare brevemente la miscela e centrifugare delicatamente i tubi utilizzando una microcentrifuga. Se si devono trasfettare diversi pozzetti con plasmidi identici, è possibile preparare una miscela madre per più pozzetti.
- Vortexare brevemente il flacone contenente Transit LT1 prima dell'uso. Aggiungere 7,5 µL di Transit LT1 per pozzetto al DNA diluito. Vortexare delicatamente la miscela, avendo cura di non far accumulare liquido nel coperchio della cryovial, e incubare per 15 min a temperatura ambiente.
- Mescolare delicatamente il complesso di trasfezione aspirando e dispensando con la pipetta. Aggiungere 100 µL dei complessi di trasfezione goccia a goccia in ciascun pozzetto. Agitare la piastra avanti/indietro e da un lato all'altro per distribuire i complessi di trasfezione. Non agitare la piastra in cerchio poiché ciò causerebbe una distribuzione irregolare dei complessi di trasfezione.
- Riportare le cellule nell'incubatore.
- Dopo 24 ore, rimuovere il sopranatante dalle cellule. Aggiungere 4 mL di DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) con 5% di FBS (Fetal Bovine Serum), 2 mM di L-glutammina, 1x pen/strep (Penicillina/Streptomicina) (DMEM5) alle cellule. Questo passaggio può essere eseguito su fino a 3 pozzetti contemporaneamente senza che i pozzetti si asciughino, a condizione che i pozzetti contengano campioni identici (altrimenti, a causa della natura autoriplicante dei trVLPs (Transcription- and Replication-Competent Virus-Like Particles) in questo sistema, il rischio di contaminazione incrociata aumenta, e questo passaggio dovrebbe essere eseguito un pozzetto alla volta).
- Riportare le cellule nell'incubatore.
Tabella 1. Quantità di DNA per la trasfezione. La quantità di ciascun plasmide richiesta per la trasfezione delle cellule produttrici e delle cellule bersaglio è indicata in ng per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
| Cellule produttrici (p0) | Cellule bersaglio (p1 e successive) | |
| pCAGGS-NP | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP35 | 125 | 125 |
| pCAGGS-VP30 | 75 | 75 |
| pCAGGS-L | 1.000 | 1.000 |
| p4cis-vRNA-RLuc | 250 | - |
| pCAGGS-T7 | 250 | - |
| pCAGGS-Tim1 | - | 250 |
Risultati
Figura 1. Tempistica di un saggio trVLP tetracistronico per 3 passaggi consecutivi. I giorni per la semina delle cellule (s), la trasfezione delle cellule (t), l'infezione delle cellule (i), il cambio di mezzo (c) e il prelievo di cellule e trVLP (h) sono indicati per tre passaggi consecutivi (indicati con frecce).
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Flacone per coltura cellulare da 75 cm² | Corning | 430641 | |
| DMEM | Sigma | D6546 | Riscaldare a 37°C prima dell'uso |
| FBS | Life technologies | 26140-079 | Inattivare al calore per 30 min a 56°C |
| L-Glutammina | Life Technologies | 25030-081 | 100x |
| Pen/strep | Life Technologies | 15070-063 | 100x |
| Piastre a 6 pozzetti | Costar | 3516 | |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985-070 | |
| Transit LT1 | Mirus | MIR 2300 |
