Saggio basato sulla luciferasi per la valutazione di composti antivirali in cellule renali embrionali umane

Abstract

Fonte: Lucas-Hourani, M. et.al., Screening ad alto rendimento per inibitori chimici a spettro ampio di virus a RNA. J. Vis. Exp. (2014)

Questo video mostra un saggio antivirale basato sulla luciferasi in cellule renali embrionali umane infettate con virus del morbillo ricombinante. Illustra come composti in esame diluiti in serie inibiscano la replicazione virale, determinando una riduzione della luminescenza in maniera dose-dipendente, mantenendo al contempo la vitalità delle cellule ospiti.

Protocollo

1. Preparazione di colture cellulari infettate dal virus del morbillo (MV) che esprime la luciferasi della lucciola (rMV2/Luc)

1. Coltivare le cellule HEK-293T a 37 °C e 5% CO₂ in mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) con L-glutammina stabilizzata e integrato con 10% di siero fetale bovino (FCS), streptomicina (100 μg/ml) e penicillina (100 IU/ml). Le cellule vengono passate mediante tripsinizzazione ogni 4-5 giorni e diluite 1:10 in un nuovo flacone. Per gli esperimenti, le cellule devono trovarsi in fase logaritmica.
2. Nel giorno dell'esperimento, recuperare le cellule mediante tripsinizzazione ed eseguire il conteggio cellulare. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere a 3 x 10⁵ cellule/ml nel mezzo di coltura. Considerare che sono necessari 12,5 ml di sospensione cellulare per ogni piastra di screening.
3. Di nuovo, risospendere le cellule a 3 x 10⁵ cellule/ml nel mezzo di coltura. Considerare che sono necessari 12,5 ml di sospensione cellulare per ogni piastra di screening.
4. Facoltativo: aggiungere uridina al mezzo di coltura alla concentrazione di 20 μg/ml.
   NOTA: Quando si effettua lo screening di librerie chimiche per inibitori della replicazione virale, spesso si isolano composti che agiscono sulle fasi iniziali della via di biosintesi delle pirimidine. L'aggiunta di uridina al mezzo di coltura serve a eliminare tali molecole antivirali. Infatti, ciò ripristina efficacemente la replicazione virale quando gli enzimi a monte della via di biosintesi delle pirimidine sono bloccati.
5. Conservare 1/10 della sospensione cellulare per i pozzetti di controllo con cellule non infette e procedere all'infezione con il volume rimanente.
6. Scongelare il volume appropriato della soluzione stock di rMV2/Luc. Le soluzioni stock di MV sono solitamente comprese tra 10⁶ e 10⁸ particelle infettive per ml. La coltura deve essere infettata con 0,1 particelle infettive di rMV2/Luc per cellula bersaglio, corrispondente a una multiplicità di infezione (MOI) di 0,1. 
   NOTA: rMV2/Luc deriva dal vaccino contro il morbillo (ceppo Schwarz) e deve essere manipolato in un ambiente BSL2.
7. Aggiungere il virus alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente. Trasferire le cellule infette in un serbatoio e distribuire 100 μl di sospensione cellulare infetta nelle colonne da 2 a 11 delle piastre D2 contenenti i composti chimici aggiunti. La sospensione cellulare nel serbatoio deve essere mescolata delicatamente a intervalli regolari.
8. Nelle colonne 1 e 12, distribuire 100 μl di cellule non infette in ciascun pozzetto. Le cellule infette vengono distribuite negli altri pozzetti.
9. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C e 5% CO₂.

2. Schermo secondario per la tossicità e l'attività antivirale a spettro ampio

1. Effettuare diluizioni seriali 1:2 per ciascun composto attivo in dimetilsulfossido (DMSO), partendo da 500 µM fino a 4 µM (8 diluizioni). Riempire piastre bianche per colture cellulari con codice a barre con 50 µl di mezzo di coltura. Aggiungere 1 µl di ciascuna diluizione del composto nei pozzetti di coltura. Ripetere due volte per ottenere 3 piastre di coltura con diluizioni seriali duplicate per ciascun composto attivo.
2. Preparare 37,5 ml di una sospensione cellulare di HEK-293T a 6 x 10⁵ cellule/ml in mezzo di coltura come descritto in precedenza (in 1.1 e 1.2). Distribuire 2x 12,5 ml in provette Falcon e infettare le cellule con rMV2/Luc a un MOI = 0,1 oppure con il virus chikungunya ricombinante (CHIKV) che esprime la luciferasi Renilla (CHIKV/Ren) a un MOI = 0,2. Mescolare capovolgendo le provette.
   NOTA: CHIKV/Ren deriva da un ceppo selvaggio di CHIKV e pertanto deve essere manipolato in un ambiente BSL3. Le piastre possono essere trasferite da BSL3 a BSL1 una volta aggiunto il substrato Renilla ai pozzetti di coltura (vedi sotto).
3. Distribuire 50 µl di cellule non infette, infette con rMV2/Luc o infette con CHIKV/Ren, nelle piastre di coltura contenenti le diluizioni seriali dei composti attivi. Incubare per 24 ore a 37 °C.
4. Aggiungere 50 µl di substrato per la luciferasi della lucciola per determinare l'attività della luciferasi della lucciola nei pozzetti infetti con rMV2/Luc. Aggiungere 50 µl di substrato per la luciferasi Renilla per determinare l'attività della luciferasi Renilla nei pozzetti infetti con CHIKV/Ren. Infine, aggiungere 50 µl di reagente per saggio di vitalità basato sulla luciferasi alle cellule non infette per determinare la vitalità cellulare.
5. Riportare i dati in grafico (Figura 1) e determinare le concentrazioni dei composti attivi che inibiscono la replicazione di MV e CHIKV del 50%. Scartare i composti che mostrano tossicità in questo saggio.

Risultati

Figura 1. Attività antivirale dose-dipendente e tossicità dei composti C864, C648 e C062. (A) Le cellule HEK-293T sono state infettate con il ceppo rMV2/Luc del virus del morbillo che esprime luciferasi (MOI=0,1) e incubate con dosi crescenti di C864, C648, C062 o solo DMSO. Dopo 24 ore, è stata determinata l'espressione della luciferasi. L'asterisco indica che le inibizioni della luciferasi osservate erano statisticamente significative con tutti e tre i composti (valori di p < 0,05). (B) Le cellule HEK-293T sono state infettate con il ceppo CHIKV/Ren del virus Chikungunya che esprime luciferasi Renilla (MOI=0,2) e incubate con dosi crescenti di C864, C648, C062 o solo DMSO. Dopo 24 ore, è stata determinata l'espressione della luciferasi Renilla. L'asterisco indica inibizioni statisticamente significative con tutti e tre i composti (valori di p < 0,05). (C) Le cellule HEK-293T sono state incubate con dosi crescenti di C864, C648, C062 o solo DMSO. Come controllo per la tossicità, i colture cellulari sono state integrate con 2,5 μl di una soluzione all'0,5% di IGEPAL. Dopo 24 ore, il numero di cellule vive è stato determinato mediante saggio di vitalità basato sulla luciferasi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piattaforma Freedom EVO	TECAN		Piattaforma robotica
Piastre da coltura cellulare in polistirene, bianche, a 96 pozzetti	Greiner Bio One	655083
Saggio luminiscente di vitalità cellulare CellTiter-Glo	Promega	G7570	Saggio di vitalità basato sulla luciferasi
Sistema per saggio luciferasi Bright-Glo	Promega	E2610	Reagente contenente il substrato della luciferasi della lucerna
Sistema per saggio luciferasi Renilla-Glo	Promega	E2710	Reagente contenente il substrato della luciferasi Renilla
Sistema per saggio genico reporter Britelite plus	Perkin-Elmer	6016761	Reagente contenente il substrato della luciferasi della lucerna. Può essere utilizzato come alternativa al reagente Bright-Glo per determinare l'attività della luciferasi.