Isolamento di un singolo virus gigante da una popolazione virale mista utilizzando amebe

Abstract

Fonte: Sahmi-Bounsiar, D. et al. Microaspirazione a Singola Cellula come Strategia Alternativa alla Selezione Fluorescente di Cellule per la Separazione di Mischie di Virus Giganti. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la microaspirazione a singola cellula per isolare ed espandere una singola popolazione di virus giganti da una popolazione virale mista, utilizzando amebe come cellule ospiti.

Protocollo

1. Coltura di amebe

1. Utilizzare Vermamoeba vermiformis (ceppo CDC19) come supporto cellulare.
2. Aggiungere 30 mL di mezzo proteasi-peptone-estratto di lievito-glucosio (PYG) (Tabella 1) e 3 mL di amebe a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL in un’ampolla da coltura cellulare da 75 cm².
3. Mantenere la coltura a 28 °C.
4. Dopo 48 h, quantificare le amebe utilizzando vetrini contatori.
5. Per il risciacquo, raccogliere le cellule a una concentrazione di 1 x 10⁶ cellule/mL e pellettizzare le amebe mediante centrifugazione a 720 x g per 10 minuti. Rimuovere il soprannatante e risospendere il pellet nel volume appropriato di mezzo di privazione per ottenere 1 x 10⁶ cellule/mL (Tabella 1).

2. Diluizione limite

1. Eseguire un’analisi per diluizioni seriali (da 10^-1 a 10^-11) del campione virale nel mezzo di privazione (Tabella 1).
2. Inoculare 2 mL di 1 x 10⁶ Vermamoeba vermiformis in ciascun piatto di Petri con 100 µL del sospeso inoculo.
3. Collocare i piatti di Petri all’interno di un sacchetto di plastica richiudibile a 30 °C.
4. Iniziare a osservare i piatti di Petri mediante microscopia ottica invertita a 6 h dall’infezione e verificare la morfologia cellulare ogni 4-8 h.
5. All’insorgenza dell’effetto citopatico, caratterizzato dall’arrotondamento delle cellule, iniziare il processo di microaspirazione singola cellula.

3. Microaspirazione di singola cellula

1. Preparare l'ospite
   NOTA: Questa preparazione viene effettuata per il rilascio di singole cellule infette su un supporto cellulare fresco.
   1. Trattare le amebe in coltura con un agente antimicrobico contenente 10 µg/mL di vancomicina, 10 µg/mL di imipenem, 20 µg/mL di ciprofloxacina, 20 µg/mL di doxiciclina e 20 µg/mL di voriconazolo. Questa miscela è utilizzata per evitare contaminazioni batteriche e fungine.
      NOTA: La procedura viene eseguita su un banco al di fuori della stazione di sicurezza microbiologica. Aggiungere 2 mL di amebe concentrate a 1 x 10⁶ cellule/mL ciascuno in 15 piastre di Petri. Per l'adesione delle amebe, incubare la coltura a 30 °C per 30 minuti.
2. Selezionare la piastra di Petri da utilizzare per la microaspirazione, in base alla diluizione limite, secondo i seguenti criteri: 1) assenza di qualsiasi contaminazione visibile da agenti fungini e batterici, 2) evidenza di effetto citopatico sulle amebe indotto dai virus e 3) fase pre-litica e arrotondamento delle amebe (per evitare l'aspirazione di particelle virali).
3. Allestiti un'area di lavoro con i seguenti materiali (Figura 1A,B): Micromanipolatore, che permette il posizionamento della microcapillare; Dispositivo manuale di controllo della pressione, utilizzato per aspirare e rilasciare le cellule nella microcapillare; Microscopio invertito; Moduli motorizzati plug and play; Telecamera; Modulo computerizzato per visualizzare la manipolazione e scattare immagini.
4. Scegliere una microcapillare (Figura 1C).
   NOTA: Le dimensioni delle cellule, la deformazione e l'adesione delle loro membrane alle superfici, nonché la motilità cellulare, possono influenzare il regolare svolgimento della microaspirazione. Il diametro della microcapillare può essere scelto e adattato con precisione a tipi cellulari specifici in base alle loro dimensioni e ai metodi di aspirazione. È stata utilizzata una microcapillare con diametro interno di 20 µm per aspirare un'ameba arrotondata (diametro ~10 µm). Ciò consente di mantenere una posizione interna stabile e un facile rilascio della cellula.
5. Montare il sistema.
   1. Fissare l'angolo operativo del sistema di presa sul modulo motorizzato a 45°.
   2. Eseguire un doppio montaggio, prima sul sistema di presa e poi sulla microcapillare.
   3. Mettere a fuoco le cellule dopo aver fatto passare alcune gocce di olio attraverso la microcapillare.
      NOTA: L'olio minerale con compatibilità biologica è fornito dal dispositivo.
   4. Completare il montaggio seguendo le raccomandazioni del produttore.
6. Clonare le cellule (Figura 2A,B)
   1. Posizionare la piastra di Petri contenente 2 mL di amebe infette sotto il microscopio.
   2. Mettere a fuoco prima le cellule, quindi la microcapillare immersa nella coltura.
   3. Selezionare una singola cellula arrotondata e avvicinare la microcapillare al micromanipolatore.
   4. Esercitare un'aspirazione delicata mediante il controllo manuale della pressione sulla cellula, aspirandola all'interno della microcapillare. Rimuovere la singola cellula dal primo campione e rilasciarla nel supporto cellulare, quindi incubarla a 30 °C.
   5. Eseguire osservazioni quotidiane con un microscopio ottico invertito per monitorare l'aspetto delle cellule e l'insorgenza dell'effetto citopatico.

Tabella 1: Composizione dei mezzi di coltura

Risultati

Figura 1: Materiali per la micromanipolazione. (A) Configurazione reale della stazione di lavoro. (B) Illustrazione schematica dei componenti della stazione di lavoro. (C) Illustrazione schematica della microcapillare.

Figura 2: Passaggi della microaspirazione. (A) Procedura di isolamento di singole cellule (ingrandimento x40). (B) Illustrazione schematica dei diversi passaggi della microaspirazione di singole cellule: 1) Localizzazione della cellula. 2) Aspirazione della cellula. 3) Fase di rilascio. Le frecce nere indicano la microcapillare e quelle bianche indicano la singola cellula.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Flaconi per coltura cellulare Corning da 150 cm²	Sigma-aldrich	CLS430825	Coltura
Flaconi per coltura cellulare Corning da 25 cm²	Sigma-aldrich	CLS430639	Coltura
Flaconi per coltura cellulare Corning da 75 cm²	Sigma-aldrich	CLS430641	Coltura
Camera DFC 425C	LEICA	Unkown	Osservazione/Monitoraggio
Microscopio invertito Eclipse TE2000-S	Nikon	Unkown	Osservazione/Monitoraggio
Microcapillare da 20 µm	Eppendorf	5175 107.004	Microaspirazione e rilascio delle cellule
Micromanipolatore InjectMan NI2	Eppendorf	631-0210	Posizionamento del microcapillare
Piastra di Petri da 35 mm	Ibidi	81158	Coltura/osservazione