Smistamento basato sulla fluorescenza di singole particelle virali per l'analisi genomica

Abstract

Fonte: Zeigler Allen, L., et al. Isolamento e Analisi del Genoma di Singoli Virioni mediante 'Genomica del Singolo Virione' J. Vis. Exp. (2013).

Questo video dimostra come la citometria a flusso permetta l'isolamento di singoli virus contenenti genoma da popolazioni miste mediante rilevamento basato sulla fluorescenza e un ordinamento preciso delle particelle, seguito da inclusione in agarosio per la successiva caratterizzazione genomica.

Protocollo

1. Preparazione delle sospensioni virali

Prima dell'isolamento di singoli virioni mediante citometria a flusso, preparare sospensioni virali non fissate.

1. Isolare le particelle virali utilizzando protocolli precedentemente stabiliti, assicurandosi che la sospensione virale finale sia contenuta in TE (Tris-EDTA, pH 8) filtrato su filtro da 0,1 μm. Si consiglia l'utilizzo di metodi di filtrazione tangenziale a flusso (TFF), anche se sono stati sviluppati altri approcci basati sulla flocculazione chimica.
2. Enumerare le particelle virali utilizzando protocolli consolidati, ad esempio mediante epifluorescenza 8-10 o citometria a flusso.
3. Aliquotare la sospensione virale in due provette Eppendorf (il volume finale consigliato è di 1.000 μl).

2. Citometria a flusso

1. Per ordinare i virus utilizzando il citometro a flusso BD FACSAria II dotato di un PMT personalizzato per la diffusione in avanti (FSC PMT), diluire le particelle virali in TE filtrato a 0,1 μm, pH 8,0, fino a una concentrazione appropriata per un tasso di eventi di 200 eventi sec^-1.
2. Impostare le soglie per massimizzare il rapporto segnale-rumore; ad esempio, per un insieme misto contenente particelle fagiche T4 e lambda, si raccomandano i seguenti valori: FSC PMT a 1.000 e SSC a 200.
3. Eseguire 100 μl di campioni "bianco" contenenti esclusivamente 1) TE filtrato a 0,1 μm e 2) TE filtrato a 0,1 μm e SybrGreen1 diluito 1e-4 rispetto alla soluzione madre (10.000X).
4. Eseguire un piccolo aliquota (si raccomandano 100 μl) di sospensione virale non colorata per valutare il fondo, seguita dalla sospensione virale colorata (SybrGreen1 diluito 1e-4 rispetto alla soluzione madre), raccogliendo fino a un totale di 5.000 eventi ciascuna. Questo passaggio serve per verificare la concentrazione e regolare, se necessario, le finestre di selezione prima dell'ordinamento. Si raccomanda una finestra stretta al centro delle particelle virali. Inoltre, per generare le finestre di selezione si utilizza il grafico SYBR Green rispetto a FSC PMT.
5. Aggiungere 5 μl di agarosio al 1% a basso punto di fusione (LMP) (in tampone TBE) raffreddato a 37 °C in ogni pozzetto di un vetrino microscopico in politetrafluoroetilene (PTFE) (Electron Microscopy Sciences).
6. Inserire il vetrino PTFE nel citometro a flusso per catturare le particelle virali ordinate.
7. Iniziare l'ordinamento delle particelle virali colorate con SYBR Green direttamente sul vetrino PTFE contenente agarosio LMP. Si raccomanda di ordinare 10 o più eventi (particelle virali) in alcuni pozzetti per facilitare il rilevamento della profondità dei virus durante la microscopia a scansione laser confocale (CSLM).
8. Al termine dell'ordinamento, rimuovere il vetrino dal citometro a flusso e aggiungere ulteriori 5 μl di agarosio LMP raffreddato a 37 °C in ogni pozzetto, incorporando così la/e particella/e virale/i.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tampone TE 1X	Invitrogen	12090-015
Fenolo saturo con tampone	Invitrogen	15513-039
Agarosio a basso punto di fusione (LMP)	Invitrogen	16520100
Vetrino microscopico in PTFE	Electron Microscopy Sciences	63430-04	24 pozzetti, diametro 4 mm
β-agarasi	New England Biolabs	M0392S