Arricchimento di virus giganti da campioni d'acqua ambientali mediante l'uso di amebe

Abstract

Fonte: Bou Khalil, J. Y.,et al. Una Strategia Rapida per l'Isolamento di Nuovi Faustovirus da Campioni Ambientali Utilizzando Vermamoeba vermiformis. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video illustra l'arricchimento di virus giganti da un campione ambientale di acqua mediante co-coltura su amebe, al fine di consentire la rilevazione e l'analisi successiva.

Protocollo

1. Raccolta dei campioni

1. Prelevare 70 campioni da diversi ambienti e regioni. In questo caso, utilizzare i seguenti: 5 campioni di acqua sporca dal villaggio di Saint Pierre de Meyzoargues (Francia), 15 campioni dal lago del Parc Borély a Marsiglia (Francia); 15 campioni di acqua di mare con sedimenti provenienti dalle insenature rocciose di Samena a Marsiglia (Francia), 25 campioni di acqua fluviale dalle Alpi (Francia) e infine 10 campioni di acque reflue da La Ciotat (Francia).
2. Vortexare i campioni per l'omogeneizzazione prima dell'inoculo, per un minuto a temperatura ambiente senza alcun trattamento.

2. Procedura di isolamento

1. Preparazione dell'ospite per le procedure di coltura cieca e inoculo del campione
   1. Utilizzare Vermamoeba vermiformis (ceppo CDC19) come supporto cellulare per la co-coltura.
   2. Mantenere gli amebe a 28 °C, in un flacone da coltura cellulare da 75 cm² con 30 ml di mezzo proteasi-peptone-estratto di lievito-glucosio (PYG). Verificare la composizione del PYG in Tabella 1.
      NOTA: Dopo 48 ore, gli amebe vengono quantificati mediante un conteggio standard utilizzando camere di conta (ad esempio, Kovaslides).
   3. Raccogliere le cellule a una concentrazione di 5 x 10⁵ a 10⁶ cellule/ml e pellettizzare gli amebe mediante centrifugazione a 720 x g per 10 minuti.
   4. Rimuovere il soprannatante per aspirazione e risospendere il pellet di amebe in 30 ml di soluzione salina amebica sterile di Page (PAS) Tabella 1. Ripetere questa procedura di risciacquo.
   5. Risospendere gli amebe in 30 ml di mezzo di digiuno contenente una miscela di antibiotico e antimicotico a una concentrazione di circa 10⁶ amebe/ml. Il mezzo di digiuno è un mezzo di sopravvivenza per l'ameba, che permette loro di rimanere vive senza formare cisti né moltiplicarsi. Verificare la composizione in Tabella 1.
      NOTA: La miscela di agenti antimicrobici conteneva 10 µg/ml di vancomicina, 10 µg/ml di imipenem, 20 µg/ml di ciprofloxacina, 20 µg/ml di doxiciclina e 20 µg/ml di voriconazolo. Questa miscela ha lo scopo di ridurre la contaminazione batterica e fungina che potrebbe ridurre o alterare la moltiplicazione virale.
   6. Inoculare direttamente 25 µl di ciascun campione sul monolayer di 200 µl di amebe in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto, che favorisce l'adesione degli amebe, e incubare a 30 °C in un ambiente umido (un ambiente umido consiste nel posizionare una compressa bagnata all'interno del sacchetto contenente la piastra per evitare l'evaporazione). Questa è la coltura primaria. Lasciare due pozzetti di amebe senza inoculo di campione; questi fungono da controllo negativo. Incubare questa coltura primaria per tre giorni.
   7. Tre giorni dopo il primo inoculo, effettuare una subcoltura della piastra della coltura primaria su amebe freschi come descritto in precedenza, senza alcuna osservazione microscopica. Incubare la nuova piastra per tre giorni nelle stesse condizioni della coltura primaria.
   8. Eseguire la coltura finale dopo questi tre giorni di incubazione nello stesso modo della coltura primaria e della subcoltura. Incubare la coltura finale per due giorni. Procedere quindi al rilevamento.

Tabella 1. Ricette delle soluzioni

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Mezzo proteasi-peptone-estratto di lievito-glucosio (PYG), soluzione salina per amebe di Page (PAS), mezzo di digiuno	Produzione interna del laboratorio	Marseille URMITE	x
Stirpe di ameba CDC-19	ATCC	Francia	50237
Piastre	Cellstar	Francia	655180
Flaconi	SARSTEDT	Germania	833911
Ultracentrifuga Sorval WX 80	Thermo scientific	Francia	9102448