Questo video illustra il saggio di focolai fluorescenti utilizzato per quantificare il virus dell'epatite C infettivo in coltura cellulare. Viene mostrata la diluizione seriale del supernatante virale, l'infezione di cellule di epatoma e la rilevazione dei siti di replicazione virale mediante microscopia a fluorescenza basata su anticorpi.
Articolo metodologico
Quantificazione del virus dell'epatite C infettivo mediante microscopia a fluorescenza
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
1. Misurazione del titolo virale
- Piastrare cellule naive Huh-7.5.1 a circa 3 x 103 cellule/pozzetto utilizzando una piastra a 96 pozzetti. Il giorno successivo, effettuare diluizioni seriali di ordine 10 del surnatante di coltura acellulare raccolto da cellule trasfettate con RNA del virus dell'epatite C (HCV) utilizzando mezzo di crescita e inoculare in triplice copia su cellule Huh-7.5.1.
- Fissare le cellule a 72 ore post-infezione utilizzando metanolo (per 30 min a -20 ºC) ed eseguire una immunomarcatura per la proteina NS5A dell'HCV.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte e bloccare con tampone di bloccaggio per IFA.
- Utilizzare un anticorpo primario policlonale coniglio anti-NS5A o un anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 in una diluizione 1:200 (1 μg/ml) e incubare da 5 ore a tutta notte a 4 ºC.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte dopo l'anticorpo primario.
- Aggiungere un anticorpo secondario policlonale caprino anti-IgG coniglio-488 o un anticorpo secondario policlonale caprino anti-IgG mouse-594 in una diluizione 1:1.000 (1 μg/ml) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con PBS per tre volte e osservare mediante microscopio a fluorescenza.
- Utilizzare la diluizione più elevata per contare le aree positive per NS5A e calcolare il numero medio di unità formanti focolai (FFU) per millilitro. Vedere Figura 1 per il titolo dell'HCV.
Risultati
Figura 1. Analisi della infettività dell'HCV di tipo selvaggio e misurazione del titolo virale. A) Cellule naive Huh-7.5.1 sono state utilizzate per gli studi di infezione. Il soprannatante acellulare raccolto a 48 e 96 ore dopo la trasfezione (hpt) di RNA di HCV è stato sottoposto a diluizioni seriali decadi e aggiunto alle cellule in una piastra a 96 pozzetti in triplice replicazione. A 72 ore post-infezione, le cellule sono state fissate e immunomarcate per la proteina NS5A di HCV. Le cellule con colorazione positiva per NS5A (rossa) sono infette con il virus. Per la valutazione dell'Unità Formante Focolai (FFU), i focolai positivi alla diluizione più elevata sono stati contati. Sono mostrati pannelli rappresentativi di immagini (barra della scala: 100 μm). B) Nel grafico sono riportati i valori medi e le deviazioni standard del titolo virale in unità formanti focolai (FFU) per millilitro. Il mutante nullo della polimerasi non ha prodotto particelle infettive. WT: tipo selvaggio; Pol-: polimerasi nullo.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) | Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Huh-7.5.1 | The Scripps Research Institute | La linea cellulare è stata gentilmente fornita dal Dr. Francis Chisari al Dr. Arumugaswami in base a un MTA stipulato tra The Scripps Research Institute e Cedars-Sinai Medical Center | |
| Anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 | English & Scientific Consulting Kft. | 10010200 | |
| Secondario anticorpo policlonale caprino anti-topo IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11008 | |
| Secondario anticorpo policlonale caprino anti-topo IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11020 |
