Questo video illustra l'uso della chimica click e della microscopia a fluorescenza per visualizzare la trascrizione dell'RNA nascente nelle cellule di mammifero. Mette in evidenza come l'infezione virale sopprima la trascrizione dell'ospite mediante il confronto dei segnali fluorescenti tra cellule infette e cellule di controllo.
Articolo metodologico
Visualizzazione della soppressione trascrizionale in cellule infettate da virus
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30 settembre 2026
In questo articolo
Abstract
Protocollo
Infettare le cellule con il virus della febbre del Rift Valley (RVFV) ceppo MP-12 ed etichettare l'RNA nascente con 5-etinil uridina (EU)
- Piastrellare cellule renali embrionali umane 293 (HEK293) in una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti con mezzo di crescita (Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) contenente 10% di siero fetale bovino, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina). Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO2 fino a quando le cellule hanno raggiunto una confluenza dell'80 - 100%.
- Infettare le cellule con MP-12 a una multiplicità di infezione (MOI) di 3. Includere almeno due pozzetti non infettati: uno dei due fungerà da controllo non infettato, l'altro verrà trattato con actinomicina D (ActD). Rimuovere il mezzo di crescita e diluire il ceppo virale in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto sia di 400 μL. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO2.
- Rimuovere l'inoculo e aggiungere 2 mL di mezzo di crescita fresco per pozzetto. Incubare a 37 °C per 12 ore.
NOTA: Se si adatta questo protocollo per l'uso con un altro virus, è consigliabile eseguire un esperimento in funzione del tempo per determinare il punto temporale ottimale per l'etichettatura e il raccolto. Impostare questo esperimento in modo che i tempi di infezione siano sfalsati e tutti i campioni possano essere etichettati, raccolti e colorati contemporaneamente.
- A 12 ore post-infezione (hpi), sostituire il mezzo di crescita con un mezzo contenente 0,5 mM di EU. In uno dei pozzetti mock-infettati, aggiungere anche 5 μg/mL di ActD. Questo servirà come controllo per la soppressione della trascrizione, poiché l'ActD inibisce la sintesi dell'RNA dipendente dal DNA. Reintrodurre le cellule nell'incubatore.
- A 13 hpi, lavare le cellule una volta con soluzione salina tamponata al fosfato (PBS) e raccoglierle mediante tripsinizzazione. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
NOTA: Durante questo e i passaggi successivi, non centrifugare le cellule a velocità superiore a 500-1.000 x g per evitare la rottura cellulare. Centrifugare le cellule per 1-2 minuti per sedimentarle.
NOTA: Se si prevede una immunomarcatura superficiale dopo la reazione click, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto di gomma o uno scraper cellulare monouso.
- Fissare le cellule risospendendole in 1 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Lavare una volta con 1 mL di PBS-EDTA per pozzetto. Procedere immediatamente al passaggio 2.
NOTA: È importante procedere immediatamente con la reazione click, poiché l'RNA degrada se mantenuto a questo stadio per periodi prolungati. Analogamente, se si esegue un esperimento in funzione del tempo, assicurarsi di etichettare, fissare e colorare tutti i campioni contemporaneamente.
Reazione Click per Rilevare l'RNA Etichettato
- Permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di Triton X-100 allo 0,2% in PBS. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate nei passaggi 2.1 a 2.3 devono essere prive di nucleasi.
- Lavare tre volte con 1 mL di PBS per pozzetto.
- Rimuovere i coprioggetti dalla piastra a 12 pozzetti e trasferirli in una camera umidificata. Coprire ciascun coprioggetto con 50 - 100 μL di soluzione di colorazione click (100 mM Tris pH 8,5, 1 mM CuSO4, 20 μM azide fluorescente [massimo di eccitazione/emissione: 590/617 nm], 100 mM acido ascorbico). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT) al buio.
NOTA: Per assemblare la camera umidificata, rivestire il fondo di una piastra per colture cellulari o di una capsula di Petri da 10 cm con pellicola di paraffina plastica. Rivestire l'interno del bordo della piastra con tovaglioli di carta inumiditi. Posizionare i coprioggetti sulla pellicola di paraffina plastica.
NOTA: Prestare attenzione a non far asciugare i coprioggetti durante questo o qualsiasi altro passaggio del protocollo. È preferibile aggiungere la soluzione di colorazione a ciascun coprioggetto immediatamente dopo averlo posizionato nella camera umidificata.
NOTA: Preparare la soluzione di colorazione click fresca immediatamente prima di questo passaggio. Soluzioni stock di Tris 1,5 M pH 8,5, CuSO4 100 mM e acido ascorbico 500 mM possono essere conservate a 4 °C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione stock di acido ascorbico che abbia assunto un colore giallo.
NOTA: Assicurarsi di scegliere un fluorocromo compatibile con i filtri del microscopio a fluorescenza in uso.
- Rimuovere i coprioggetti dalla camera umidificata e posizionarli in una piastra a 12 pozzetti pulita, quindi lavarli tre volte con 1 mL di PBS per pozzetto.
- Montare i coprioggetti posizionando una goccia (circa 15 μL) di Fluoromount-G su un vetrino. Immergere il coprioggetto in H2O, rimuovere l'eccesso di H2O toccando il bordo su un tovagliolo di carta e posizionare il lato cellulare verso il basso nella goccia di Fluoromount-G. Lasciare asciugare all'aria per 5 minuti.
NOTA: Se si esegue l'immagine con un microscopio invertito, lasciare solidificare il Fluoromount-G a 4 °C durante la notte oppure fissare i coprioggetti al vetrino sigillandone i bordi con smalto trasparente.
NOTA: I preparati possono essere analizzati immediatamente o conservati a 4 °C al buio per un massimo di una settimana.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-Etinil uridina | Berry Associates | PY 7563 | Sciogliere in DMSO per ottenere una soluzione madre da 100 mM |
| Coverslip rotondo da 12 mm | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| Actinomicina D (ActD) | Sigma | 9415 | Sciogliere in DMSO per ottenere una soluzione madre da 10 mM |
| Microscopio a fluorescenza | ad es. Olympus IX71 | ||
| CuSO₄ | Sigma | C-8027 | Sciogliere in H₂O per ottenere una soluzione madre da 100 mM |
| DMEM (mezzo di Eagle modificato di Dulbecco) | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS (siero fetale bovino) | Invitrogen | 16000044 | |
| Azide fluorescente (accoppiata ad Alexa Fluor 594) | Invitrogen | A10270 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-ascorbato | Sigma | A-5960 | Sciogliere in H₂O per ottenere una soluzione da 500 mM |
| Paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| Penicillina-Streptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| Base di Trizma | Sigma | T-1503 | sciogliere in H₂O per ottenere una soluzione madre da 1,5 M, pH 8,5 |
