Analisi della soppressione trascrizionale dell'ospite indotta da virus mediante citometria a flusso

Abstract

Fonte: Kalveram, B., et al. Utilizzo della chimica click per misurare l'effetto dell'infezione virale sulla sintesi dell'RNA nelle cellule ospiti. J. Vis. Exp. (2013)

In questo video viene illustrato l'utilizzo della chimica click e della citometria a flusso per misurare la soppressione della trascrizione cellulare indotta da virus. Le cellule di mammifero vengono infettate con un virus che esprime una proteina di virulenza nucleare in grado di interrompere il complesso del fattore di trascrizione dell'ospite, mentre le cellule di controllo rimangono attive dal punto di vista trascrizionale. L'incorporazione di 5-etinil uridina etichetta l'mRNA appena sintetizzato, consentendo la quantificazione dell'attività trascrizionale nelle cellule infette e in quelle di controllo mediante rilevamento di doppia fluorescenza.

Protocollo

1. Infetta le cellule con MP-12 ed etichetta l'RNA nascente con 5-etiniluridina (EU)

1. Sezionare cellule 293 in una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti con mezzo di crescita (DMEM contenente 10% di siero fetale bovino, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina). Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO₂ fino a quando le cellule non avranno raggiunto una confluenza dell'80-100%.
2. Infettare le cellule con MP-12 a un m.o.i. di 3. Includere almeno due pozzetti non infettati: uno dei due fungerà da controllo non infettato, l'altro verrà trattato con ActD al passaggio 1.4. Rimuovere il mezzo di crescita e diluire la scorta virale in modo che il volume totale aggiunto a ciascun pozzetto sia di 400 μl. Incubare per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% CO₂.
3. Rimuovere l'inoculo e aggiungere 2 ml di mezzo di crescita fresco per pozzetto. Incubare a 37 °C per 12 ore.

NOTA: Se si adatta questo protocollo per l'uso con un altro virus, è consigliabile eseguire un esperimento in funzione del tempo per determinare il punto temporale ottimale per l'etichettatura e il prelievo. Impostare questo esperimento in modo che i tempi di infezione siano sfalsati e tutti i campioni possano essere etichettati, prelevati e colorati contemporaneamente.

4. A 12 h.p.i., sostituire il mezzo di crescita con un mezzo contenente 0,5 mM di EU. In uno dei pozzetti non infetti (mock), aggiungere anche 5 μg/ml di ActD. Questo servirà come controllo per la soppressione della trascrizione, poiché l'ActD inibisce la sintesi di RNA dipendente dal DNA. Reintrodurre le cellule nell'incubatore.
5. A 13 h.p.i., lavare le cellule una volta con PBS ed eseguire il raccolto mediante trypsinizzazione. Lavare le cellule raccolte tre volte con PBS contenente 1 mM di EDTA (PBS-EDTA).

NOTA: Durante questo e i passaggi successivi, non centrifugare le cellule a velocità superiori a 500 - 1.000 x g per evitare la rottura cellulare. Centrifugare le cellule per 1-2 minuti al fine di ottenere il sedimentamento.

NOTA: Se si prevede una immunomarcatura della superficie dopo la reazione di click, raccogliere le cellule utilizzando un raschietto di gomma o un raschietto cellulare monouso.

6. Fissare le cellule risospendendole in 1 ml di PFA al 4% e incubare per 30 min a temperatura ambiente.
7. Lavare una volta con 1 ml di PBS-EDTA per pozzetto. Procedere immediatamente al passaggio 6.

NOTA: È fondamentale procedere immediatamente con la reazione di click, poiché l'RNA si degrada se mantenuto a questo stadio per periodi prolungati. Allo stesso modo, se si esegue un esperimento in corso di tempo, assicurarsi di etichettare, fissare e colorare tutti i campioni contemporaneamente.

2. Reazione di "click" per rilevare l'RNA marcato

1. Permeabilizzare le cellule risospendendole in 0,5 ml di Triton X-100 0,2% in PBS. Incubare per 10 min a temperatura ambiente.

NOTA: Tutte le soluzioni utilizzate nei passaggi 2.1 a 2.3 devono essere prive di nucleasi. Se le cellule non sedimentano correttamente durante questo passaggio, aumentare il tempo di centrifugazione a 5 min. Il comportamento di sedimentazione migliorerà una volta che le cellule saranno sospese nel buffer FACS.

2. Lavare una volta con 1 ml di PBS.

NOTA: Non utilizzare EDTA in questo passaggio, poiché ciò chelerebbe gli ioni Cu²⁺ necessari per la reazione di click.

3. Risospendere le cellule in 200 μl di soluzione di marcatura mediante click chemistry (100 mM Tris pH 8.5, 1 mM CuSO4, 200 nM azide marcata con colorante fluorescente [massimo di eccitazione/emissione: 650/665 nm], 100 mM acido ascorbico). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.

NOTA: Preparare la soluzione di colorazione click fresca immediatamente prima di questo passaggio. Le soluzioni stock di Tris 1,5 M a pH 8,5, CuSO₄ 100 mM e acido ascorbico 500 mM possono essere conservate a 4 °C. Tuttavia, scartare qualsiasi soluzione stock di acido ascorbico che abbia assunto un colore giallo. Se le cellule si raggrumano durante questo passaggio, risospendere pipettando su e giù diverse volte. Assicurarsi di scegliere un fluorocromo rilevabile dal proprio citometro a flusso. Preparare anche un campione di cellule infette che non venga sottoposto alla procedura di colorazione click; questi saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Utilizzare metà delle cellule infette oppure includere una pozzetta aggiuntiva infetta al passaggio 1,2.

Lavare due volte con buffer FACS (PBS contenente 1 mM EDTA e 0,5% (p/v) BSA).

3. Immunofluorescenza per rilevare l'espressione delle proteine virali

1. Risospendere le cellule in 200 μl di anticorpo primario (anti-RVFV) diluito in tampone FACS (1:10.000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.

NOTA: In alternativa, questo passaggio può essere eseguito tutta la notte a 4 °C al buio.

NOTA: Preparare anche un campione di cellule non infette sottoposto alla procedura di colorazione con click chemistry ma che non verrà immunomarcato; questi campioni saranno necessari per la calibrazione del citometro a flusso. Utilizzare metà delle cellule mock-infette oppure includere una pozzetta aggiuntiva non infetta al passaggio 1.2.

NOTA: Quando si adatta questo protocollo per l'uso con un virus diverso, determinare prima la diluizione ottimale per l'anticorpo primario.

2. Lavare le cellule due volte nel buffer FACS.
3. Risospendere le cellule in 200 μl di anticorpo secondario (anti-IgG di topo coniugato con colorante fluorescente [massimo di eccitazione/emissione: 495/519 nm]) diluito nel buffer FACS (1:1.000) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio.
4. Lavare le cellule una volta nel buffer FACS.

NOTA: A questo punto, le cellule possono essere conservate tutta la notte a 4 °C al buio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
5-ethynyl-uridina	Berry Associates	PY 7563	sciogliere in DMSO per ottenere una soluzione madre da 100 mM
Coverslip rotondi da 12 mm	Fisherbrand	12-545-82
Provette in polistirene da 5 ml	BD Biosciences	352058
Actinomicina D (ActD)	Sigma	9415	sciogliere in DMSO per ottenere una soluzione madre da 10 mM
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG	Invitrogen	A-11029
Albumina sierica bovina (BSA)	Santa Cruz	sc-2323
CuSO₄	Sigma	C-8027	sciogliere in H2O per ottenere una soluzione madre da 100 mM
DAPI	Sigma	D-9542	sciogliere in H2O per ottenere una soluzione madre da 5 mg/ml
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
azide fluorescente (accoppiata ad Alexa Fluor 594)	Invitrogen	A10270
azide fluorescente (accoppiata ad Alexa Fluor 657)	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
acido L-ascorbico	Sigma	A-5960	sciogliere in H2O per ottenere una concentrazione di 500 mM
carta filtro	VWRbrand	28333-087
paraformaldeide	Sigma	158127
Penicillina-Streptomicina	Invitrogen	15140122
poli-L-lisina (PM ≥ 70000)	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma base	Sigma	T-1503	sciogliere in H2O per ottenere una soluzione madre da 1,5 M, pH 8,5
Tripsina-EDTA	Invitrogen	25200056
Microscopio a fluorescenza			ad es. Olympus IX71
Citometro a flusso			ad es. BD Biosciences LSRII Fortessa